胃癌组织中Krüppel 样因子4、过氧化物还原酶1 的表达及与临床特征的关系△

毛奇琦，黄家鑫，许旭东，潘独伊，王昕海，孙旭#

复旦大学附属华山医院（宝山院区）1消化科&内镜中心，2普外科，上海2019070

胃癌是严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤，其发病率在中国恶性肿瘤中居首位，根据相关调查报告显示，每年中国新发胃癌患者已超过40万例，且逐渐呈年轻化趋势[1]。由于胃癌本身具有隐匿性，加上医疗条件不充分，多数患者确诊时已到中晚期，成为进展期胃癌，肿瘤已发生局部转移，失去手术治疗的机会[2]。中国是胃癌高发国家，对于晚期胃癌患者，及时给予化疗，其生存期也难以超过12 个月[3]。因此研究胃癌的发病机制，寻找早期诊断的分子标志物是目前临床研究的重点内容。Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）在人体多种组织中存在，在不同组织中有不同的靶基因相互作用，参与细胞的增殖和凋亡[4]。过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1，PRDX1）在对抗活性氧簇、抗氧化过程中发挥关键作用，参与多种疾病的发生发展[5]。目前为止，关于KLF4、PRDX1 与胃癌之间的关系尚未明确。本研究旨在探讨胃癌组织中KLF4、PRDX1 的表达及与临床特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018 年10 月至2020 年10 月复旦大学附属华山医院（宝山院区）收治的胃癌患者的病历资料。纳入标准：①符合《胃癌规范化诊疗指南（试行）》[6]中的相关诊断标准；②未接受放化疗及其他针对性肿瘤治疗；③符合外科手术治疗适应证；④心肝肾及血常规正常；⑤临床资料齐全。排除标准：①心、脑、肝、肾等严重器官功能衰竭；②未成功随访；③具有酒精及药物滥用史；④存在活动性细菌或真菌感染；⑤有高血压，且服用降压药物无法控制；⑥合并第二原发肿瘤。根据纳入、排除标准，共纳入70 例胃癌患者，其中男性40 例，女性30例；年龄25～75 岁，平均（48.22±5.12）岁；体重指数16～26 kg/m2，平均（22.35±2.25）kg/m2；肿瘤直径2～8 cm，平均（4.01±1.43）cm；临床分期：Ⅰ期28 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期7 例；分化程度：高中分化30 例，低分化40 例；浸润程度：T1～235 例，T3～435例；有淋巴结转移50 例，无淋巴结转移20 例；有血管神经侵犯30 例，无血管神经侵犯40 例；有远处转移10 例，无远处转移60 例。取70 例胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 资料收集

收集70 例胃癌患者的性别、年龄、临床分期、分化程度、随访复发情况等临床资料。患者出院后，每3 个月采用门诊复查、电话访问等多种方式进行随访，随访时间1 年，随访日期截至2021 年10月，随访率为100%。

1.3 KLF4 和PRDX1 检测方法

采用免疫组化法检测KLF4 和PRDX1 蛋白表达情况，标本均在4%多聚甲醛中过夜，自来水清洗，梯度乙醇浓度从低向高逐级脱水，脱水后胃癌组织用氯仿透明，每次1 h，透明后在石蜡中浸透，行石蜡包埋，切片裱于载玻片上，晾干。常规脱蜡，梯度乙醇复水，3%H2O2避光孵育20 min，蒸馏水冲洗；切片放入抗原修复盒内，高温修复10 min，冷却至室温取出切片，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3 次；滴加PBS 稀释的一抗，37 ℃孵育箱内复温40 min，PBS 冲洗3 次；滴加生物素化二抗工作液，PBS 冲洗3 次；二氨基联苯胺显色，1 ml 蒸馏水中加入显色剂，避光保存，自来水冲洗；苏木素复染，脱水，封片。细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度：棕褐色为3 分，棕黄色为2 分，淡黄色为1 分，无阳性染色为0 分；阳性细胞所占比例：＞75%为3 分，25%～75%为2 分，＜25%为1 分，无阳性细胞为0分。染色强度和阳性细胞所占比例评分之和＞2分为阳性，≤2 分为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件分析数据，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中KLF4、PRDX1 表达情况的比较

胃癌组织中KLF4 阳性表达率明显低于癌旁组织，PRDX1 阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 胃癌组织和癌旁组织中KLF4、PRDX1 表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中KLF4、PRDX1 表达情况的比较

不同性别、年龄、肿瘤直径、血管神经侵犯情况胃癌患者的胃癌组织中KLF4 阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同临床分期、浸润程度、分化程度、淋巴结转移情况及远处转移情况胃癌患者的胃癌组织中KLF4 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=5.657、5.833、4.088、37.333、6.572，P＜0.05）。不同性别、年龄、血管神经侵犯情况胃癌患者的胃癌组织中PRDX1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、临床分期、浸润程度、分化程度、淋巴结转移情况及远处转移情况胃癌患者的胃癌组织中PRDX1 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=6.437、6.638、6.437、4.057、21.282、8.867，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中KLF4、PRDX1的表达情况

3 讨论

据相关数据统计，胃癌的发病率居各种恶性肿瘤首位，呈明显的地区分布差异，中国、日本为胃癌的高发国家[7]。由于早期诊断的普及、手术及化疗的进步，胃癌的治疗已有较大发展。除了对胃癌的早期诊断、病因预防及手术治疗外，还需全面了解胃癌的生物学行为[8]。既往有研究显示，胃癌的侵袭性与多种分子有关，包括致癌基因激活、多种生长因子受体异常、遗传不稳定性等，其会使肿瘤细胞获得存活和增殖的优势[9]。但目前关于肿瘤抑制基因的改变在疾病发生发展过程中的机制尚无明确定论。

KLF4 主要在消化道黏膜和上皮细胞中表达，其参与细胞的增殖、分化等生命过程的调控，与肿瘤的发生和发展密切相关[10]。KLF4 在早期肠腺瘤、结肠腺癌、前列腺癌、食管癌中表达降低，而在口腔鳞状细胞癌、原发性乳腺导管癌中表达升高。尽管不同肿瘤中KLF4 的表达水平不同，但均表明其在肿瘤的发生发展过程中有重要作用[11]。胃癌具有转移迅速的特点，这与胃癌细胞的上皮-间充质转化有关，在上皮-间充质转化过程中，胃癌细胞在多种基因作用下具有较强的迁移和侵袭能力，出现肿瘤转移[12]。PRDX1 在细胞氧化还原过程中有重要调节作用，其对氧化应激非常敏感。有研究显示，PRDX1 在结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中的表达升高，其通过调节多种信号通路参与肿瘤的增殖和侵袭[13-14]。本研究结果显示，胃癌组织中KLF4阳性表达率明显低于癌旁组织，PRDX1阳性表达率明显高于癌旁组织；不同临床分期、浸润程度、分化程度、淋巴结转移情况及远处转移情况胃癌患者的胃癌组织中KLF4 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同肿瘤直径、临床分期、浸润程度、分化程度、淋巴结转移情况及远处转移情况胃癌患者的胃癌组织中PRDX1阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明胃癌组织中KLF4表达明显降低，PRDX1 表达明显升高，其促进了胃癌的发生和发展，可作为判断早期胃癌预后的指标。KLF4主要表达于皮肤及胃肠道分化的上皮细胞中，进一步研究发现，在结肠癌细胞中能够观察到KLF4某些位点的缺失，转录水平的甲基化修饰，其与肿瘤细胞的侵袭有关，提示了KLF4 的潜在抑癌作用[15-16]。KLF4 在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异证实其在维持胃肠道黏膜稳态中的重要作用。正常生理代谢和病理因素均会诱导活性氧产生，导致蛋白质氧化剂脂质过氧化，进而导致肿瘤的发生发展，其中PRDX1 具有抗氧化和清除自由基等多种生物学功能[17]。目前的研究发现，PRDX1 既可阻断正常细胞的恶性转化，又可抑制肿瘤细胞内活性氧诱导的凋亡，具有双重作用[18-19]。肿瘤的转移是一个复杂的过程，转移灶是否能形成受到机体免疫情况、局部微循环等多个方面的影响，需要对参与研究的患者进行长期随访，明确其与肿瘤转移和复发的关系，寻找更科学有效的治疗方案，在微转移时给予针对性治疗，扼杀早期的肿瘤细胞，争取良好的预后[20]。本研究存在以下不足之处：未进行大样本研究；本研究所选择样本均来自同一医院的单一科室，未进行多中心点的实验研究；本研究所纳入的研究时间间隔较短，未进行多时间段的实验研究，故需要后续学者进行多中心、大样本及较长时间跨度或者多时间段的进一步深入研究。

综上所述，胃癌组织中KLF4 表达明显降低，PRDX1 表达明显升高，其促进了胃癌的发生和发展，可作为判断早期胃癌预后的指标。