HIV NL4-3病毒株非感染性细胞-细胞融合模型的构建

石哲芳,罗春雨,李亚飞,刘 奇

获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的一类传染性疾病。根据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)2021年报告,截止2020 年年底,全球现存活HIV感染者人数达到3 770 万,其中2020 年新发HIV感染者有150万,AIDS相关死亡人数达68万[1]。

在HIV-1感染过程中,病毒包膜糖蛋白(Env)介导的膜融合是HIV-1进入靶细胞的关键步骤,并决定了病毒株的细胞嗜性。基于病毒与靶细胞表面辅助受体结合能力的不同,HIV-1毒株可分为3种类型:R5型、X4型和R5X4型[2]。其中,利用CCR5辅助受体的分离株称为R5型病毒,利用CXCR4辅助受体的分离株称为X4 型病毒,既能利用CCR5又能利用CXCR4 的称为R5X4 型或双嗜性病毒。其中,HIV-1的实验室病毒株NL4-3(X4型)[3],被用来进行抗HIV-1药物的活性测定。

但是,HIV-1的活病毒检测需要在P3 级生物安全实验室进行,从而限制了HIV-1进入抑制剂的研究活动。研究首先构建了一种能同时表达NL4-3的env基因及绿色荧光蛋白GFP的真核表达质粒并瞬转293T 细胞作为效应细胞,以表达CCR5 和CXCR4 的TZM-b1 细胞作为靶细胞,用于检测HIV-1介导的细胞-细胞融合的检测模型。该模型是一种无病毒感染风险、可视化、能够在普通实验室进行操作的HIV-1进入抑制剂检测模型。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、质粒、细胞和多肽 感受态细胞(DH-5α)购自天根生物科技有限公司。克隆载体p AAVIRES-GFP、含有HIV-1 NL4-3env基因的表达质粒pCDNA-NL4-3、HEK-293T 与TZM-b1 细胞均由本实验室保存。多肽C34、T1144由浙江昂拓莱司公司合成。其中C34 序列为:WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;T1144 序列为:TTWEAWDRAIAEYAARIEA LLRALQEQQEKNEAALREL。

1.1.2 主要试剂EcoRI、XhoI等限制性内切酶及T4 DNA Ligase购自Takara公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase PCR 扩增试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;快速小提质粒试剂盒、大提质粒试剂盒、DNA 纯化试剂盒均购自天根生化科技有限公司;EZ Trans细胞转染试剂购自Life-iLab李记生物;DMEM 培养基及细胞冻存液购自大连美仑生物科技有限公司;胎牛血清购自TheromoFisher公司;胰蛋白酶、青链霉素混合液、BSA、TMB、4%福尔马林缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司。带有人Fc标签的CD4蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司。NaCl、KCl、Na2HCO3、KH2PO4、枸橼酸、H2O2购自天津市福晨化学试剂有限公司,羊抗人IgG 购自赛默飞世尔科技中国有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank 中HIV NL4-3的env基因序列(登录号:MN685349)及其上下游序列设计PCR 引物,由昆明擎科生物科技有限公司合成。其中上游引物(NL4-3-F):5′-GGAATTCCGGAGACAGCGACGAAGA-3′;下游引物(NL4-3-R):5′-CCTCGAGGTCTGCTGCTGGCTCAGCT-3′(下划线处分别是EcoRI和XhoI酶切位点)。

1.2.2 NL4-3env基因的扩增 以含有NL4-3env基因的质粒pcDNA-NL4-3为模板进行PCR 扩增。扩增体系:2×Phanta Max Buffer 50μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 2μL,d NTP Mix(10 mmol/L each)2μL,NL4-3-F 4μL,NL4-3-R 4μL,DNA 模板4μL,补水至100μL。反应条件:95 ℃30 s;95 ℃15 s,60.7 ℃15 s,72 ℃3 min,共30个循环;72 ℃延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 重组质粒p AAV-IRES-GFP-NL4-3env的构建 将PCR 扩增产物用天根胶回收试剂盒回收纯化,回收产物与p AAV-IRES-GFP分别用EcoRI和XhoI双酶切。酶切体系:EcoRI和XhoI各2 μL,10×Fast Digest Green Buffer 10μL,DNA 2 μg,补水至100μL。37 ℃酶切20 min后于1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,酶切产物经纯化后与p AAV-IRES-GFP载体连接。连接体系:载体100 ng,插入片段与载体以7:1 摩尔比加入,10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL,T4 DNA Ligase 1μL,补水至20μL,均匀混合后至4 ℃反应过夜。连接产物转化DH-5α感受态细胞,涂板培养后挑取单个克隆,小提质粒进行酶切验证,含有3.1 kbp条带的阳性克隆送测序。

1.2.4 细胞培养及转染 293T 细胞与靶细胞TZM-b1均采用添加10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM 培养基,在37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养。用于转染的293T 细胞于转染前24 h铺于6孔板,每孔约5×105个细胞。待贴壁细胞的密度达80%左右,且细胞形态良好时,采用Life-iLab李记生物公司的EZ Trans转染试剂进行转染。主要步骤如下:取质粒DNA 3μg加到125μL无血清和抗生素的DMEM 培养液中,作为稀释质粒;取EZ Trans 9μL加到125μL 无血清和抗生素的DMEM 培养液中,作为稀释后的EZ Trans转染试剂。然后将稀释好的EZ Trans转染试剂一次性全部加入到已经稀释好的质粒DNA 当中。室温放置15 min,形成EZ Trans复合物。将上述250μL EZ Trans-DNA 转染复合物均匀滴入293T 细胞的培养孔中,轻轻摇晃培养使EZ Trans-DNA 复合物均匀分布。在5% CO2培养箱中37℃下孵育细胞。转染后12～18 h,弃去含EZ Trans-DNA 复合物的培养基,更换新鲜培养液,培养至36～48 h。其中,转染p AAV-IRES-GFPNL4-3质粒的293T 细胞命名为293T/NL4-3/EGFP细胞,转染p AAV-IRES-GFP质粒的293T 细胞命名为293T/EGFP细胞。

1.2.5 细胞ELISA 检测培养细胞NL4-3env的表达水平 参照文献[4]介绍的方法并稍作改进。1)去除稳定表达p AAV-IRES-GFP-NL4-3和p AAVIRES-GFP细胞的培养上清,用PBS洗2次;2)每孔加入125μL 10%甲醛室温固定15 min,双蒸水洗3次,晾干;3)每孔加入250μL 含2% BSA 的PBS,37 ℃封闭1 h,双蒸水洗3次;4)加入1% BSA 的PBS稀释后的带有人Fc标签的CD4(1∶5 000)50 μL,37 ℃孵育2 h,双蒸水洗板5次;5)加入50μL含1%BSA 的PBS稀释的羊抗人IgG(1∶10 000),37 ℃孵育1 h,双蒸水洗板5次;6)加入TMB显色剂50 μL,室温显色20 min,加 入25 μL 10%H2SO4溶液终止反应,用酶标仪在450 nm 波长下测OD值,此OD 值反应293T/NL4-3/EGFP、293T/EGFP细胞上NL4-3env的表达水平。

1.2.6 NL4-3env介导的细胞-细胞融合 细胞融合前一天将靶细胞TZM-b1铺于96孔板,每孔约5×104个细胞。在96 孔培养板上,将稳定表达HIV-1包膜蛋白env的效应细胞293T/NL4-3/EGFP和阴性对照细胞293T/EGFP,与含有CD4受体和CXCR4辅助受体的靶细胞TZM-b1混合,在5%CO2培养箱中37 ℃条件下培养,并于不同时间点使用荧光显微镜的绿色荧光通道观察细胞融合情况。

1.2.7 阳性药物的抑制活性测定 以C34 和T1144为HIV 进入抑制剂阳性药物[5-6],测定其在本模型的抑制活性。293T/NL4-3/EGFP 与TZMb1共培养作为阳性孔;293T/EGFP 与TZM-b1共培养作为阴性孔;以C34和T1144与293T/NL4-3/EGFP及TZM-b1共培养作为检测孔。于2 h后,计算各孔的细胞融合情况,同时计算检测孔中C34及T1144对细胞融合的抑制率。抑制率＝[1－(E－N)/(P－N)]×100%。其中“E”代表实验组的细胞融合率;“P”和“N”分别代表阳性组和阴性组的细胞融合率。半数抑制浓度(IC50)使用Calsusyn软件进行计算。

2 结果

2.1 293T/NL4-3/EGFP的质粒构建、转染及鉴定以HIV NL4-3的DNA 为模板,扩增env的全长基因。经双酶切后连接入p AAV-IRES-GFP载体,并转化至DH-5α感受态细胞进行培养。抽提质粒,用EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定,得到6.1 kbp的载体片段和3.1 kbp的env基因片段(图1A),提示重组p AAV-IRES-GFP-NL4-3env质粒构建成功。测序后Blast结果与HIV NL4-3env基因完全吻合。

p AAV-IRES-GFP-NL4-3经大提质粒后,转染293T 细胞(293T/NL4-3/EGFP),结果如图1B。可见该质粒能成功表达GFP,转染效率良好,可以进行后续的融合实验。

为了进一步验证NL4-3env的表达情况,使用细胞ELISA 检测不同细胞的env表达水平(结果见图1C)。其中,293T 细胞OD 值为(0.092±0.006);p AAV-IRES-GFP转染后的293T 细胞,其OD 值为(0.147±0.033);转染p AAV-IRES-GFP-NL4-3的293T 细胞,OD 值达(0.904±0.112)以上。其P/N 值(P:OD293T/NL4-3/EGFP,N:OD293T/EGFP)为(6.15±2.13)≥2.1,提示转染后的293T 细胞(293T/NL4-3/EGFP)可成功表达NL4-3env。

图1 293T/NL4-3/EGFP的质粒构建、转染及env 表达鉴定Fig.1 Plasmid construction,transfection and env expression identification of 293T/NL4-3/EGFP

2.2 293T/NL4-3/EGFP与TZM-b1细胞的融合根据文献报道,NL4-3 病毒可以感染TZM-b1[7]。因此我们首先使用TZM-b1 作为细胞融合实验的靶细胞。将p AAV-IRES-EGFP-NL4-3 以及p AAVIRES-EGFP 分别转染至293T 细胞,获得293T/NL4-3/EGFP细胞与293T/EGFP细胞。然后将其与TZM-b1共同孵育。该效应细胞特异识别TZMb1细胞上的CD4、CXCR4受体,两者发生融合。结果如图2。

将293T/NL4-3/EGFP 效应细胞与TZM-b1靶细胞在37 ℃共同培养2 h后,细胞与细胞发生融合,融合与未融合细胞相比,面积增大,荧光强度变弱。这是由于细胞发生融合的同时,EGFP 从293T/NL4-3/EGFP效应细胞扩散到靶细胞TZMb1中,导致绿色荧光在细胞中重新分布。对照组293T/EGFP并没有发生融合,表明这是由NL4-3env介导的细胞融合。

共培养24 h后,细胞与细胞之间形成更大的融合,在光学视野和荧光视野下都能看到。与实验组相比,对照组在培养过程中,既没有发生融合,也没有形成大的合胞体。之后我们进一步使用DAPI对融合细胞(2 h的融合形态)进行细胞核染色。DAPI为一种可以穿透细胞膜并和细胞核中的双链DNA 结合的荧光染料,在364 nm 波长激发后可以产生比DAPI自身强20多倍的蓝色荧光。经DAPI染核以后,我们可以清楚的看到,发生融合的细胞可见2个或更多的细胞核,见图3框选区域。而没有融合的细胞只有一个细胞核。这进一步证实了,图中绿色荧光范围增大,荧光变暗的细胞是293T/NL4-3/EGFP细胞与TZM-b1细胞融合的产物。

图3 融合细胞的细胞核染色(20×)Fig.3 Nuclear staining of fused cells(20×)

2.3 HIV 进入抑制剂的活性检测 为检测在该模型上HIV 进入抑制剂的效果,我们选用了HIV 进入抑制剂C34和T1144进行方法验证,同时用EK1作阴性对照(一种冠状病毒融合抑制剂)[8]。结果表明(图4),HIV 进入抑制剂C34、T1144均以剂量依赖的方式有效地抑制了NL4-3env诱导的细胞-细胞融合,而EK1 则对NL4-3 融合没有抑制作用。其中,C34的IC50为(72±6.24)nmol/L,T1144的IC50为(15±6.94)nmol/L,均与前人报道的IC50值(低nmol/L水平)相当[5-6,9]。

图4 NL4-3 env 介导的细胞-细胞融合模型上HIV进入抑制剂抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of HIV entry inhibitor on envmediated cell-cell fusion model of NL4-3

3 讨论

临床治疗艾滋病主要采用的是由逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合使用的高效抗逆转录病毒疗法 (Highly activate anti-retroviral therapy,HAART),又称“鸡尾酒疗法”[10]。但长期使用此疗法可引起严重不良反应,并且容易诱导HIV 突变,从而导致耐药问题日益严重[11]。为了解决艾滋病毒耐药性问题,对新型抗逆转录病毒药物的需求日益增加。因此迫切需要可靠和简单的检测方法来检测候选抗艾滋病毒药物。

进入抑制剂在病毒进入靶细胞前就能发挥作用,在感染最初阶段就可将病毒传播路径切断。因此在预防和治疗HIV 感染方面具有独特的优势。HIV-1进入靶细胞包括3 个主要步骤:gp120 与CD4结合,然后与共受CXCR4或CCR5结合,随后gp41发生构象变化,导致病毒和靶细胞膜融合[12]。根据病毒进入靶细胞的过程,HIV 进入抑制剂可分为:吸附抑制剂、辅助受体抑制剂、融合抑制剂。其中吸附抑制剂是靶向gp120与CD4结合的抑制剂;辅助受体抑制剂是靶向CCR5或CXCR4的共受体结合的抑制剂;融合抑制剂是以gp41为作用靶点,通过阻止gp41介导的膜融合过程中功能性六螺旋体(six-helix bundle,6-HB)结构的形成,进而阻断HIV 进入靶细胞的一类抑制剂[13]。

细胞-细胞融合模型是用于检测HIV 进入抑制剂的重要方法。传统的HIV 细胞细胞融合模型是将感染有HIV-1活病毒的H9细胞与靶细胞MT2进行融合,进而作为进入抑制剂的筛选方法[14]。但此方法中H9细胞呈HIV 的慢性整合感染状态,具有感染性,因此只能在P3实验室进行。为了减少实验室感染风险,学者尝试构建一些无感染性的细胞-细胞融合模型,用于进入抑制剂的筛选。其中,王小利等[15]建立的基于包膜蛋白和Tat蛋白筛选HIV-1细胞融合抑制剂的方法,利用编码β-半乳糖苷酶和荧光素酶的报告基因来进行细胞-细胞融合分析。由于引入相应可重复的报告基因,从而使实验更加便于定量分析。然而,当2种细胞融合时,影响任一蛋白之间的相互作用过程,均会导致报告基因的变化,导致这些分析可能减少细胞-细胞融合模型的特异性。另一种是使用2种不同荧光亲脂性探针的基于荧光的细胞融合分析,细胞融合必须通过流式细胞术进行定量,不便于快速筛选HIV-1进入抑制剂[16]。

参照课题组前期构建的无感染、可视化MERSCo V 检测模型[17],本研究构建了一种无感染性的、可肉眼观察的HIV-1检测模型。该研究首先构建了表达HIV NL4-3env并同时表达GFP 的细胞(293T/NL4-3/EGFP),用于模拟病毒的进入过程,从而与靶细胞产生细胞融合,构建了一个能明显形成合胞体的无感染性HIVenv诱导的细胞-细胞融合检测体系。由于使用的是表达HIV-1包膜蛋白的293T 细胞模拟病毒与靶细胞的融合过程,从而避免了HIV 感染的风险,此外,该方法简单方便,成本较低,具有很高的特异性,可在荧光显微镜下计数,因此可在普通生物实验室进行,并可望发展成为一个用于检测HIV 进入抑制剂的非感染性高内涵(High Content Screening,HCS)药物筛选模型[18]。

利益冲突:无

引用本文格式:石哲芳,罗春雨,李亚飞,等.HIV NL4－3病毒株非感染性细胞－细胞融合模型的构建[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):496-501.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.070