不同血清群致病性钩端螺旋体PFGE分析研究

李 喆,张 影,杜宗利,叶 强,徐颖华,辛晓芳

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的人兽共患自然疫源性疾病[1-2]。其病原体菌型复杂,抗原性各异。传统的血清学分类常用来鉴定钩体分离菌株,目前全世界已发现了24个血清群近300种不同血清型钩体。由于血清凝集试验和凝集素交叉吸收试验需要大量标准菌株,且不同血清群存在一定交叉反应[3-4],已满足不了钩体病流行趋势改变现状的监管与科研的需求。

随着钩体研究的不断深入以及分子生物技术的发展,各种细菌分子分型方法被应用于致病性钩体分型研究。研究人员基于钩体16S核糖体RNA(ribosome RNA,r RNA)基因在其种属进化的多态性特征性序列,可将钩体分为致病性、中间型和腐生型三大类,致病性钩体中包括问号(L.interrogans)、波氏(L.borgpetersenii)、卫氏(L.weilii)等10种基因种[3,5]。通过对病原菌染色体分型脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型技术具有重复性好、分辨力强、较易标准化等优点,在发现和监控包括钩体等诸多病原体及其溯源方面发挥了重要作用[6-8]。此外,其他分型方法例如多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)[3,9-10]和多位点串联重复序列数变化分析(multilocus VNTR analysis,MLVA)[11-12]方法,也不断被发展并应用于钩体的基因多态性研究。本研究应用PFGE方法对不同血清群致病性钩体国际和国内参考菌株进行了PFGE 分型研究,并与MLVA 及MLST 分型结果进行比较,结合菌株16S r RNA 基因测序分析结果,并以此探讨研究致病性钩体的种群结构和遗传溯源关系,为后续钩体分子分型及流行病学研究提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 菌株 58株不同血清群致病性钩体国际、国内参考菌株与7株疫苗株以及PFGE 分析用沙门氏菌标准菌株H9812均来自中国食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂及仪器 Seakem Gold 琼脂购自美国Lonza公司;限制性内切酶XbaⅠ、NotⅠ、蛋白酶K 和Taq酶购自大连宝生物公司;DNA 提取试剂盒购自美国Promega公司;其他试剂均为国产分析纯。CHEF MAPPERTM XA 脉冲场凝胶电泳系统和Versa Doc-MP4000 凝胶成像系统均购自美国BioRad公司。

1.3 细菌培养 将钩体菌株接种于含10%兔血清的磷酸盐培养基中,放置28 ℃培养7～14 d。离心收集菌体,按照说明书进行菌体基因组的提取,基因组DNA 样品放置－20 ℃保存备用。

1.4 PFGE检测分析 参照文献[13]方法进行致病性钩体PFGE检测分析,即制备钩体PFGE 分析胶块,然后用限制性内切酶NotⅠ(10 U)于37℃酶切3 h后,上机电泳20 h(初始脉冲5 s、终脉冲65 s),染色后拍摄图像保存。应用Bio Numerics软件对PFGE结果图像进行聚类分析。

1.5 MLVA 分型 使用本课题组既往发表的文献[11]与新鉴定的钩体菌株VNTR 数据,通过Bio Numerics软件进行聚类分析。

1.6 PFGE、MLST 和MLVA 分型方法比较 3种不同分型方法的分辨力采用Simpson 差异指数(Discrimination Index,DI)作为评价指标,计算公式如下DI＝1－∑(Ni(Ni－1))/(N (N－1)),其中Ni为研究样本中第i种型别的样本数,N 为研究样本的总数。钩体菌株MLST 分型数据来源于本实验室既往研究数据[14]。

2 结果

2.1 致病性钩体PFGE 分型 不同血清群致病性钩体基因组DNA 经NotⅠ酶切电泳后,获得了较高清晰度酶切图谱,各条带分离良好,可分辨的片段条带数在8～20条。条带主要分布在25～500 kb,均位于标准菌株H9812经酶切后的最小和最大片段分别为20.5 kb和1 135 kb。

根据菌株PFGE 酶切图谱条带数量及位置完全相同定为同一型别,有1条或以上条带差异为不同型别,将65株钩端螺旋体菌株分为61种PFGE型别,命名为P1～P61。其中P17型别含有3株菌,分别为56601、56620和56679;P8和P20型别分别含有2株菌,而其他型别仅含有1株菌,包括5株疫苗株和5株国际参考株。黄疸出血群疫苗株56001和犬群疫苗株611分别为P17和P20型,而56101和56104国际参考株的PFGE 图谱均为P8 型(见图1)。

图1 65株钩体菌株PFGE、MLST、MLVA和16S r RNA分型结果Fig.1 Genotyping results with PFGE,MLST,MLVA and 16S rRNA of 67 Leptospira strains

PFGE分析结果显示,相同的血清群的钩体菌株可分为不同的PFGE 型别。例如4 株致热群菌株包含P5、P6、P30和P41型别,而6株秋季群菌株分别属于6 种不同PFGE 型别(P3、P4、P11、P21、P31和P52);但也发现一些相同血清群菌株具有相同的PFGE 图谱,例如2株黄疸出血群菌株56101和56104均为P8 型,3 株黄疸出血群菌株56601、56620和56679均为P17型别,2株犬群菌株56603和611均为P22型。不同血清群之间并未发现具有相同的PFGE图谱。

2.2 致病性钩体PFGE谱型聚类分析 运用Bionumerics软件,对菌株各PFGE 型别在聚类关系中的相似度进行分析。以60%相似度水平对65 株钩体菌株进行分类,可以发现存在11个簇,分别命名为C1～C11,共包含56株钩体菌株,见图1。其中C1～C6和C11所包含菌株的基因亚种均为问号,涵盖大部分PFGE 图谱型别;C10均为波氏亚种组成,包含P56和P57型别;C7含有18种不同PFGE图谱株,是最大的一个簇,内部包含多种不同钩体基因亚种,例如问号、卫氏、波氏、L.alexanderi、L.kirschneri、L.santarosai和L.alstoni(图1),这些聚类分析表明致病性钩体菌株在进化过程种并没有形成大克隆群,呈现多点分散进化。

2.3 不同分型方法的比较分析 65株钩体菌株经PFGE分型可得到61种型,DI值为0.002 4。MLST 对58株(65株中有7株未成功鉴定)钩端螺旋体菌株分型得到47种型,DI值为0.009 7。比较具有相同PFGE型别或相同MLST 型别的20株菌株的分型结果,显示有5 株菌株的PFGE 分型与MLST 分型结果完全一致,其对应型别分别为P17/1(PFGE/MLST)和P20/37(图1)。MLVA 对63株(65株中有2株未成功鉴定)钩端螺旋体菌株分型得到59种型(图2),DI值为0.002 6。比较具有相同PFGE 型别或相同MLVA 型别的11 株菌株的分型结果,显示有2株菌株的PFGE 分型与MLVA 分型结果完全一致,其对应型别分别为P17/MT20(PFGE/MLVA)(图1)。

图2 65株钩体菌株多位点串联重复序列最小生成树Fig.2 Minimum spanning tree of multiple site tandem repeats of 65 strains of Leptospira

3 讨论

钩体的血清分类法是以细菌表面O 抗原为主要靶抗原的分类法,通过交叉凝集吸收试验将钩体分成不同血清型[15]。然而,交叉凝集吸收试验需要多种抗血清,操作繁琐、耗时且难以实现标准化。随着临床分离株的数量不断增多以及基于基因的分子分型方法的日益完善,血清学方法与分子分型方法的结合更有助于钩体菌株的准确分型和新型别菌株的发现。

本研究采用中国食品药品检定研究院保藏的不同血清群的钩体国际参考菌株、国内参考菌株和钩体疫苗株,通过PFGE 方法对其进行分型,并结合16S r RNA、MLST 和MLVA 分类结果,探讨了钩体不同种群间的相互关系。

既往的研究结果发现致病性钩体PFGE 分析与血清学分型结果具有较好一致性[16]。而本研究则表明,PFGE分型图谱与其菌株血清群不尽相同,不同的血清群可以有相似度较高的PFGE 图谱,相同的血清群也可以有差异性较高的PFGE 图谱。推测这种不一致,可能是因为本研究选择的钩体菌株之间其分离时间、分离地点和宿主之间都具有较大的差异。而针对某一局部地区的钩体分型研究,钩体菌株的采集往往时间、地点和宿主都较为集中,因此血清学分型和分子分型会具有较高的一致性。因此,为了深入探讨致病性钩体PFGE 图谱与其血清型分型结果相关性,未来应开展包括更多来源广泛的代表性钩体菌株的研究。

PFGE聚类结果表明,同一簇内的钩体菌株其基因种大体是相同的。虽然C8簇包含了多个基因种,但在其内部拓扑学关系更近的菌株其基因种更一致。但同一基因种内的钩体菌株,往往具有基因型的多样性。MLST 和MLVA 方法的分型结果与基因种的关系同样如此。PFGE、MLST 和MLVA的辛普森系数分别为0.002 4、0.009 7和0.002 6,这表明3种方法都具有较高的分辨率。从具体型别看到,PFGE、MLST 和MLVA 分析结果不尽相同,可能与这3种方法分型原理不相同有关,各自分型结果也反映了菌株不同的分子遗传特征[17-18],但所呈现致病性钩体的进化规律还是基本一致,未发现形成流行菌株大克隆群,呈现多点分散进化模式。

综上,本研究针对不同血清群致病性钩体进行了PFGE分析系统,并与菌株MLST 和MLVA 分型比较分析,获得致病性钩体分子分型的第一手资料,可为钩体菌株多样性研究、新型别钩体菌株的发现和疾病防控工作提供借鉴。

利益冲突:无

引用本文格式:李喆,张影,杜宗利,等.不同血清群致病性钩端螺旋体PFGE 分析研究[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):481-485.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.091