布鲁氏菌分子诊断与分型技术研究进展

张雪健 ,吴向未, ,谢松松 ,李颜玲 ,任中业

布鲁氏菌病(简称布病),是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病[1]。世界卫生组织(WHO)和联合国粮食和农业组织(FAO)宣布,布鲁氏菌病是易被忽视的人兽共患病之一,每年在170多个国家发生约50万件新病例[1]。在中国,布鲁氏菌病是一种持久的公共卫生问题。21世纪随着中国的经济水平增加,人们的流动性大大增加,养殖业也越来也繁荣,布鲁氏菌病的发病率持续增加。自2004 年以来,感染的人畜的数量飙升,2014年达到了57 222的峰值[2-3]。人类布鲁氏菌病主要是由于暴露于布鲁氏菌感染的家畜,带菌的排泄物或进食被布鲁氏菌污染的食物,尤其是绵羊和山羊奶制品[4]。研究表明,空气温度、阳光持续时间、降雨、相对湿度、相对湿度和蒸发在季节性波动传播人体布鲁氏的传播中发挥了至关重要的作用[5]。布鲁氏菌感染后临床表现无特异性,以低烧、出汗、疲劳和关节疼痛是患者最为常见。如果布鲁氏菌病患者不被诊断和治疗,可引起全身性多系统损害。慢性布鲁氏菌病的治愈具有一定挑战性,这影响了患者的生活质量,并导致巨大的家庭和社会经济负担。

目前,针对布鲁氏菌的检测方法主要有3类:一是细菌分离鉴定,它是布病诊断的“金标准”,但布鲁氏菌的分离培养耗时长,技术较复杂,检出率低,对实验室检测条件要求较高,对试验技术人员的危险较大[6-7],存在相应的生物安全隐患。二是血清学检测,它是诊断布鲁氏菌病的重要检测方法,但其敏感性差、特异性不强、操作繁多,易受人为判断主观意识的影响等缺点,需要通过其他方法辅助才能确诊,且存在假阳性和假阴性[8-9]。三是分子生物学检测[7]。自1985年聚合酶链式反应技术问世以来,PCR 技术作为一种快速、高效、简便的体外核酸扩增技术被广泛应用于医学、生物学、食品卫生等多个领域[10]。但各种分子生物学检测方法均有优缺点,因此,全面了解布鲁氏菌病分子生物学检测方法的研究进展有助于更好的检测手段的选择。

1 分子生物学检测方法

1.1 AMOS-PCR(Abortus Melitensis Ovis Suis PCR) 由于布鲁菌种属内不同生物型或基因型的流行病学意义不同,为有效追溯传染源及遗传进化关系,有必要对引起人布鲁菌病菌株的生物型及基因型进行鉴定。由于存在不能归因于现有布鲁氏菌种的非典型生化反应的菌株的存在,使得区分和分类变得更加复杂[11]。在1968年,HOYERBH 首次用DNA-琼脂法和过滤法对布鲁氏菌属进行了分子水平上的研究[12-13],1985年,Verger等人利用现代DNA-DNA 杂交技术(细菌种类划分的金标准,实验确定的70%DNA 杂交阈值与以前的表型分类相一致),证实了不同物种之间的密切遗传关系[11,14]。基于敏感、特异、快速的PCR 技术的分子生物学方法具有广阔的应用前景[15]。随着20世纪90年代以来分子生物学技术的快速发展,分子生物学检测方法越来越广泛地用于迅速检测布鲁氏菌病[16]。1994年,Bricher和Halling首次将PCR 方法用于布鲁氏菌的分型研究,建立了AMOS-PCR[17]方法。重复遗传元件IS711(之前也被报道为IS6501)是布鲁氏菌物种特有的,并且对于大多数物种,布鲁氏菌至少有一个元件的拷贝占据了特定的染色体位点[17],AMOS-PCR 是以IS711片段设计引物,从而扩增出布鲁氏菌的DNA,可在24 h内鉴定牛种布鲁菌,羊种布鲁菌,猪种布鲁菌以及绵羊附睾种布鲁菌[17-18]。鉴定结果与传统方法符合率高,操作安全且简单快速,更具实用性,在临床布鲁氏菌检测以及实验研究中运用较为广泛[18-19]。通过AMOS-PCR对各地牲畜布鲁菌种水平的分析,为有针对性的开展疫苗免疫起至关重要的作用[15]。

1.2 巢式PCR(Nested PCR) 巢式PCR 是由PATRICIA M.等人于1992年首次提出[20],它是2个连续的PCR 反应,是使用2 对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR 引物扩增片段和普通PCR 相似。第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR 产物内部,使得第二次PCR 扩增片段短于第一次扩增[21-22]。与其他传统的PCR 方法相比,巢式PCR 降低了分子靶标检测的阈值,可提高PCR 检测的灵敏度和准确性,并提高诊断预测的准确性[21-22],不仅有助于目标扩增产物与非特异性产物的区分,并有较好的时效性[23]。从样本的DNA 提取到结果判定最快可在5 h内完成,对患者的及时快速诊断具有重要意义[24]。巢式PCR 不仅可克服单次PCR 扩增平台期效应的限制,极大地提高扩增倍数,从而提升PCR 的敏感性[21-22]。此外,由于二次扩增时模板、引物的改变,有效降低了非特异性反应连续放大的可能,提高了扩增的特异性[21,24]。但由于目前该方法缺乏统一的判定标准和规范化检测流程,限制了其在临床中的应用,尚需进一步优化提升其在临床样本检测中的稳定性和实用性。

1.3 实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR) 1999年Vogelstein and Kinzler等人提出了数字聚合酶链式反应(DPCR),2010年Scott O Sundberg等人在在此基础上提出了实时荧光定量PCR[25],使PCR 技术得到进一步发展[26],它不受其他理化因素的影响,相对普通PCR 操作简单,耗时少,减少操作中病原体的接触,有效降低生物安全风险,且可同时进行大批量检测[7,27],是一种快速、灵敏、特异的目标分子实时定量检测技术,无需进行琼脂糖凝胶电泳,将检测时间大大缩短,也无需电泳,大大降低体系污染的风险,同时对反应体系进行实时监控,实现定性又定量的目的[6,26]。为临床检测提供新兴检测手段,具有较好的潜在应用价值,但是荧光定量PCR 由于易污染、实验成本和对实验场所要求较高等原因不易在基层推广[7,24,28],导致其在临床中的应用不太广泛,但是由于实验室设备较为完善,其应用较为普遍,是科学研究中较为常用的方法。

1.4 环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 环介导等温核酸扩增技术由Notomi 2000年发明[29],是一种在近年来有极大发展前景的核酸扩增技术,这种技术使用了DNA 聚合酶和一组4个特别设计的引物(DNA 正、反义链序列的内引物、外部引物),它们总共识别目标DNA 上的6 个不同的序列。内引物启动LAMP,外部引物启动的链置换DNA 合成释放出单链DNA。这作为DNA 合成的模板,由第2个内外引物启动,与目标的另一端杂交,产生茎环DNA结构。循环反应继续进行中,最终产物是具有目标的几个反向重复的茎环DNA 和具有多个环的花椰菜状结构,这些结构是通过在同一链中目标的交替反向重复之间退火而形成的,因此它有望高选择性地扩增靶序列[29]。它可以用肉眼直接判定,使得成本大幅下降,便捷性明显提高,而且不需要专用的仪器,只需4个引物、DNA 聚合酶和常规实验室水浴或热块即可进行反应[29-30],它在等温条件下扩增DNA 具有高特异性、高效率和快速的特点,灵敏性较高、扩增时间短[29]。对于家畜布病检测及基层卫生防疫有十分重要的意义[31]。但LAMP的效率取决于靶DNA 的大小,在30～200 bp的DNA 效果最好,超过500 bp的DNA 扩增效果很差,无法对长片段进行扩增,其扩增结果只有扩增与不扩增,对非特异扩增产物也无法区分,并且该技术操作过程容易受气溶胶污染,造成假阳性结果的出现[29-30]。而我们在常规实验操作中,各种实验均在同一个大环境中进行,专门为其准备一个独立的封闭的空间不切实际,气溶胶的产生不可避免,且无特异性检测,导致其在临床中的实用性较低。

1.5 微滴式数字PCR(droplet digital PCR) 微滴式数字PCR 由Christopher M Hindson 等人于2013年提出,他们将纳升大小的液滴技术与数字PCRdigital PCR 相结合形成微滴式数字PCR[32],微滴式数字PCR 将一个待分析的PCR 反应体系进行微滴化处理,每个微滴中含有一个、多个或不含有待检测的核酸靶分子,数万个微滴进行独立PCR 扩增反应后,对每个微滴的荧光信号进行统计学分析,含有荧光信号的微滴判读为1,不含荧光信号则判读为0,从而实现对病原体DNA 或RNA 的绝对定量,实现高精度的绝对核酸定量[10,32]。目前已被应用于病原微生物检测、肿瘤相关基因检测等多个领域[6,10,32]。这是一种新兴的技术,与传统的荧光定量PCR 方法相比,微滴式数字PCR 技术的定量方式不依赖于标准曲线,它在检测低浓度DNA 方面具有更高的灵敏度和准确性[6,33]。最低检测限达到单个拷贝,灵敏度高于荧光定量;特异性强;重复性好,批内和批间变异系数均小于10%[33-34];在临床中,对于低细菌载量样品的检测,可实现对临床样品的绝对定量,为布鲁氏菌的诊断和防控提供可靠保障[6]。但是数字PCR 方法仍存在一定的缺陷,由于对数万微滴进行检测,故检测时间较长、单位时间内所能产生的数据量较低,即通量低[6,33]。通量低一定程度上会导致测序速度较慢、时间长,测序数量较少,在样本量较多时应用受到限制,故临床中应用不广泛。

2 布鲁氏菌分子分型数据分析检测方法

2.1 多位点序列分型(Multi locus sequence typing,MLST) 多位点序列分型是一种基于DNA 序列的分型方法,可用于许多不同细菌物种的菌株区分和克隆谱系鉴定,由Maiden 等人1998 年提出[35]。在MLST 中,来自多个管家基因内部片段的核苷酸序列确定的等位基因的直接分配是明确的,并且每个基因座可以区分更多的等位基因[35]。所有基因座上的每一种独特的等位基因图谱都被识别为一种序列类型[36]。通过聚类分析,根据多位点等位基因图谱的两两差异构建树状图。MLST 可以应用于几乎所有的细菌物种和其他单倍体生物,包括那些难以培养的生物[35,37]。多个基因座的使用对于实现提供菌株间有意义关系所需的分辨率至关重要,因为克隆随着年龄的增长而多样化,这是突变或重组事件的结果,如果只检查单个基因座,可能会被错误地分型[35,37]。

在布鲁氏菌中,根据之前发表的MLST 数据库[38-39],选择9个不同的基因组位点,所选的9个基因座中有7个代表了MLST 中常规使用的传统管家基因类型,因为累积的变化发生得很慢,并且被认为是选择性中性的[39-40]。其余使用的位点是omp25的片段,编码一个25 k Da的外膜蛋白,作为一个潜在的更可变的表面标记,可能有助于区分密切相关的经典物种和标记为int-Hyp的片段,该片段基本上是基因间的,尽管它确实包括假设蛋白质的极端5’。所选择的基因座散布在布鲁氏菌基因组中,因此一个基因座上的变化应该独立于其他基因座[39-40]。即7个管家基因、1个外膜蛋白和1个基因间片段[39-40]。这9个基因座的每个等位基因都被赋予了不同的数字名称[36]。根据组成每个ST 的全部9个DNA 片段的串联核苷酸序列构建邻接树,以检验STS之间的关系[39],再使用软件Bio Numerics Version 5.1(Application-Maths,Inc.)用UPGMA 进行聚类分析。使用Bio Numerics软件5.1版构建最小生成树(MST),确定从一个菌株到网络上所有其他菌株的最小进化路径[36]。2016年,Adrian M.Whatmore等[41]在9个基因座的MLST基础上,添加了代表12 个额外信息的管家基因片段,以表征总共21个不同的基因组位点。这些数据极大的增加了对布鲁氏菌遗传多样性的了解,拓展了对布鲁氏菌进化史、基因型和生物群之间的关系研究,以进一步研究这些问题,为未来新出现的非典型分离株的分类以及可靠和准确的快速诊断、分析提供了一个更全面的框架[41]。

在中国,MLST 方法识别出18种已知的ST 段类型:ST7、ST8、ST34、ST35 和ST37、ST1、ST2、ST5、ST28、ST29、ST30、ST31、ST32、ST33 和ST38(流产B.biovar1和3),以及ST14、ST17 和ST36(B.suisbiovar1和3)[2,36,42]。对无根的系统发育树的研究表明,STS归入与经典分类学划分基本一致的类群。虽然ST6(对应于B.bortusbiovar3)与剩余的B.bortusSTS不同,但B.melitensis和B.bortus都属于得到良好支持的簇[43]。该方法已被广泛应用于地方和全球层面的微生物分型和流行病学研究,并产生对研究种群结构和系统发育关系非常理想的数据[39,44]。

2.2 多位点变数串联重复分析(Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA) 2002年,第一个布鲁氏菌全基因组序列(B.melitensis16M)被公布[45],紧随其后的是猪布鲁氏菌1 330株的基因组序列[46]。比较全基因组分析证实这些基因组的遗传亲缘关系较近(平均核苷酸同源性在99%以上),与DNA-DNA 杂交结果一致。在大多数物种中,存在着进一步分化为生物群的现象。在遗传上,所有的布鲁氏菌物种之间都有很高的亲缘关系,在比对区域(核心基因组)显示出98%到100%的序列相似值[11]。2006年,Le F等开发了一种基于多位点变数串联重复分析的基因分型方法[47],极大地促进了基因分型和流行病学研究[48]。在布鲁氏菌中,具有21个位点(MLVA-21)和MLVA-16(1,22,41)的MLVA 方案使用分布在布鲁氏菌基因组上的多个重复标记的组合,能够区分布鲁氏菌的分离株。具有广泛的时间和地理渊源或非常接近的渊源[49],MLVA-16应用较广泛且数据库中的数据较多。MLVA-16 系统包括8 个小卫星或Pane1 标记(Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45和Bruce55)和8个互补的微卫星或Pane2 标记,分为Pane2A(Bruce18、Bruce19和Bruce21)和Pane2B(Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16和Bruce30)。MLVA8(Panel 1)被认为适用于布鲁氏菌的物种鉴定,而Panel 2B标记被认为适用于亚种分化,因为Panel 2B基因座中的3个(bruce04、bruce09、bruce30)是Bricker等人描述的高变量八聚体寡核苷酸指纹可变数目串联重复序列(蹄印)MLVA 基因座的一部分[50]。MLVA16(Panel 1 ＋Pane2)适用于基因型鉴定[46,51]。多位点可变数目串联重复分析(MLVA)已被证实是鉴定和分型布鲁氏菌分离株的有用工具,这些数据已被用于流行病学调查[52]。目前,MLVA-16检测正被用于分析不同毒株之间的流行病学相关性。这种方法还可以通过比较内源性菌株和外来菌株的遗传模式来追踪地理来源[52-53]。高度区分性的多位点可变数目串联重复序列(VNTR)分析(MLVA)可以对单个分离株进行物种描述和区分,因此是暴发调查中分子流行病学研究的一种完美的第一线工具[11,53]。虽然MLVA 是一种高效的菌株聚类工具,但它不是一种系统发育工具,因为快速进化的VNTR 标记往往存在同源性问题[11]。

与其他分子分型方法相比,MLST 与MLVA的压倒性优势是序列数据真正可以在实验室之间进行比较,允许每个物种有一个不断扩大的全球数据库放在万维网(World Wide Web)上,从而能够通过互联网交换全球流行病学的分子分型数据[35,41]。可以很容易在实验室之间比较序列数据,并且存储在单个扩展的中央多位点序列数据库中的数据可以通过互联网以电子方式进行查询,以产生用于全球流行病学的强大资源[35-36,41]。

3 小结与展望

PCR 技术的检测敏感性、效率、准确性高,能够为布鲁氏菌病的诊断和治疗提供强有力的证据,已成为当前布鲁氏菌病分子生物学检测和病原学分型的重要手段。单重PCR 可一次性鉴别布鲁氏菌的菌种,在检测时直接取感染动物或患者临床血液组织,十分便捷,方便在基层推广应用。多重PCR 是利用多对引物在同一个反应体系中对多个靶基因进行扩增检测,该技术应用灵活性强,灵敏度高,可快速检测鉴别多种病原体,在临床多种病原体混合感染的鉴别诊断上具有独特优势。然而,分子生物学检测需培养细菌,灭活菌株,有二次感染的风险,对实验室环境、仪器要求高,需要在专门的实验室操作,且实验试剂价格昂贵,不适合在基层推广,但在科学研究中具有较高的实用性,且在大数据时代,PCR 与基因测序、生信分析等技术结合,利用全球数据库平台,可研究细菌的流行病学和分子生物学特征,以及其与临床特征之间的相关性,指导临床诊断和治疗。

利益冲突:无

引用本文格式:张雪健,吴向未,谢松松,等.布鲁氏菌分子诊断与分型技术研究进展[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):533-538.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.073