1例宏基因二代测序提示钩端螺旋体感染患者的实验室诊断

孙爱猛 ,周信云 ,罗滢娟 ,朱端昊 ,熊长辉

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体引起的一种急性全身感染性疾病,属于自然疫源性疾病[1]。钩端螺旋体病在发病早期有高热、全身酸痛、软弱无力等症状,随着病程延长,会引起肺弥漫性出血、心肌炎、呼吸功能衰竭等严重并发症,甚至威胁患者生命[2]。由于钩端螺旋体病临床表现多样性和钩端螺旋体实验室检测的特殊性,很多病例被漏诊,现就对一不明原因发热伴呼吸困难患者实验室诊断为钩端螺旋体感染病例进行阐述。

1 资料与方法

1.1 病例资料 2021年7月一患者,男,58岁,因乏力、咳嗽伴发热自行口服感冒类药物,症状无缓解,2 d后症状加重并出现呼吸困难住进ICU。胸部X 线片示:双肺纹理增多,呈毛玻璃样改变,可见分布均匀、大小一致的斑片状阴影,密度低,边界模糊。采集呼吸道标本做新型冠状病毒特异性核酸片段,结果为阴性。采集呼吸道标本和血液标本做常规实验室病原分离培养,未培养出可疑致病菌。根据«中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识»[3]和«宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识»[4],采集患者肺泡灌洗液进行m NGS检测提示有钩端螺旋体感染的可能,继而采集患者血液和尿液做病原分离培养和特异性核酸片段检测,结果均为阴性,但患者血清抗体检测(MAT 法)出致病性钩端螺旋体澳洲型滴度为1∶800,患者被确诊为致病性钩端螺旋体澳洲型感染。临床及时采用抗钩端螺旋体药物(用药包括青霉素、氢化可的松等)治疗后患者病情好转。经流行病学调查,该患者于7月初在自家附近的小河捕过鱼,并且该地区往年钩端螺旋体监测中在老鼠体内分离到过阳性菌株,该患者这次发病可能是接触疫水感染所致。

1.2 方 法

1.2.1 肺泡灌洗液m NGS检测 分析采集患者肺泡灌洗液送予果生物科技(北京)有限公司做m NGS检测,采用QIAseq Ultralow Input Library Kit构建文库,采用Illumina Nextseq550Dx测序平台对构建好的文库测序,使用SNAP软件筛除测序数据中的人源序列;最终获得的数据使用Burrow-Wheeler Aligner软件进行分析,评估样本中微生物的种类和是否有致病性病原微生物存在的可能。

1.2.2 Real-time PCR检测根据肺泡灌洗液m NGS检测分析结果的提示,用Real-time PCR 检测方法对患者肺泡灌洗液、血液和尿液进行钩端螺旋体特异性基因检测。核酸提取采用天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取试剂盒进行提取,提取方法参考试剂盒说明书。钩端螺旋体特异性基因Real-time PCR 扩增采用深圳市生科源技术有限公司试剂盒进行扩增,反应体系和反应条件参考检测试剂盒说明书。

1.2.3 病原体分离培养 按照WS290-2008«端螺旋体病诊断标准»[5]采集患者血液和尿液培养分离钩端螺旋体的病原:通过无菌操作采集患者血液接种3管EMJH 培养基中,每管接种1～3滴,通过无菌操作采集患者中段尿50 m L于4 000 r/min离心1 h后取沉渣接种4 管EMJH 培养基中,每管0.3 m L,血培养管和尿培养管均于28 ℃培养,每隔5～7 d取培养物于暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长。

1.2.4 显微镜凝集实验(MAT) 按照WS290-2008«端螺旋体病诊断标准»[5]采集患者血清进行钩端螺旋体MAT 检测,以检测患者血清抗体滴度和钩端螺旋体感染型别:患者血清于56℃水浴箱中灭活30 min后作定性试验,即以生理盐水做1∶50稀释,分别取稀释好的血清50μL与50μL 15个代表株的培养液混匀后于37 ℃孵育1.5～2 h,用生理盐水做对照。取孵育后的反应液于暗视野显微镜下观察凝集情况。若患者稀释血清与某一群钩端螺旋体抗原发生凝集则说明血清中该群钩端螺旋体抗体滴度是1∶100,则需要进一步稀释患者血清检测该群钩端螺旋体抗体的滴度。

2 结果

2.1 肺泡灌洗液m NGS 检测结果 肺泡灌洗液m NGS检测结果提示有钩端螺旋体感染的可能。m NGS结果显示钩端螺旋体属序列数51,问号钩端螺旋体特异系列数51,置信度高,相对丰度1.43%,覆盖度0.08%。

2.2 Real-time PCR 检测结果 用Real-time PCR检测方法对患者肺泡灌洗液、血液和尿液进行钩端螺旋体特异性基因检测,检测结果均为阴性。

2.3 病原体分离培养结果 实验室对患者血液、尿液进行钩端螺旋体的分离培养结果均为阴性。

2.4 显微镜凝集实验(MAT)结果 血清抗体检测(MAT)致病性钩端螺旋体澳洲型滴度为1∶800(见图1)。

图1 致病性钩端螺旋体澳洲型MAT结果(200×)Fig.1 Results of the MAT of pathogenic Leptospira australis type(200×)

3 讨论

钩端螺旋体病是热带亚热带地区常见的传染病,尤其是以农业为主以及洪涝灾害多发的地区,对老百姓的身体健康危害非常大,是我国南方省份需要重点防治的传染病之一[6]。钩端螺旋体病临床表现复杂,临床型别多,从轻微的感冒症状到严重的多器官衰竭并无典型的特异性,这给临床诊断带来极大困难,很多病例被漏诊,所以钩端螺旋体病的诊断在一定程度上需要依靠实验室的辅助检测。目前实验室的病原分离培养和MAT 仍是诊断和监测钩体的金标准[7-8]。但是病原体培养法培养时间较长,对钩端螺旋体活菌培养一般需要2周以上;MAT 则需要将钩端螺旋体标准菌株培养至一定浓度,再将活的标准菌株与待检血清一起孵育培养,且需要人工借助暗视野显微镜观察[9]。因此,培养法和MAT 都不能对人群行大规模的快速筛查,也不能对钩端螺旋体病进行早期诊断。

随着分子检测技术的快速发展,采用普通PCR[10]和Taq Man Real-time PCR[11-12]技术检测钩端螺旋体特异性核酸在一定程度提高了钩端螺旋体病的诊断水平。PCR 检测对样本采集、实验环境和条件要求较高,并且一对PCR 扩增引物只能获取某一特定目的DNA 片段,如果病例怀疑有哪些病原感染的可能,PCR 检测就要选择相对应病原的引物进行扩增,这在不明原因引起的病例检测中对某种病原某种引物的选择较难。特别是像钩端螺旋体病临床表现复杂,侵犯的人体脏器多、临床型别多、病原种群多的这种病原感染无论是临床医师的初诊还是实验室的检测都带来了很大的挑战。Wilson等[13]在2014 年对一例患者的脑脊液进行高通量测序提示该患者可能为钩端螺旋体感染,实验室通过PCR 和血清抗体检测也证实了该患者为钩端螺旋体感染,这是较早将高通量测序应用病原感染的检测。2019 年Xie等[14]应用m NGS 诊断管圆线虫婴儿嗜酸性脑膜炎的病例显示m NGS 是一种新的精确度较高的诊断技术,能帮助实验室检测出更多的病原体。Zhang等[15]2019 年也将m NGS 技术应用于脑膜炎的诊断中,检测出了人疱疹病毒。此外,还有学者探讨了病原微生物m NGS 在局灶性感染中的应用价值,发现其检测的阳性临床符合率明显高于常规检测法及培养法,且可能不受标本采集前抗菌药物使用的影响[16]。

在本文病例的实验室检测中,常规的实验室检测指标均不能提示是何种病原感染,经对患者肺泡灌洗液进行m NGS检测提示有钩端螺旋体感染的可能,继而采集患者血液和尿液做病原分离培养和特异性核酸片段检测,但结果均为阴性,后经患者血清抗体检测(MAT)确诊为致病性钩端螺旋体澳洲型感染。这提示我们在对钩端螺旋体的实验室诊断中新型的检测技术和传统的检测技术有机结合,互相验证,才能提高钩端螺旋体病的诊断。

利益冲突:无

引用本文格式:孙爱猛,周信云,罗滢娟,等.1例宏基因二代测序提示钩端螺旋体感染患者的实验室诊断[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):478-480,485.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.092