山药bHLH基因家族鉴定及表达分析

朱 涛,李芳菲,杨海涵,时 宁,李冰冰,王莲哲

(河南城建学院 生命科学与工程学院, 河南 平顶山 467000)

0 引言

转录因子(transcription factor)是真核生物中广泛存在的一类功能蛋白因子，其通过与DNA的顺式作用元件特异性结合来调控下游基因表达，参与生物体生长发育及环境胁迫响应等众多的生物学过程。基础螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix protein，bHLH)转录因子是真核生物中的一类重要转录因子，因其主要由碱性氨基酸区和螺旋-环-螺旋区组成而命名[1]。植物基因组中bHLH多以基因家族形式存在，在植物信号转导、生长发育、抗逆性等方面发挥着重要作用[2]。

bHLH转录因子有保守的螺旋-环-螺旋结构域，位于N末端的基本区域表现出DNA 结合活性，而两个α-螺旋的HLH区域在蛋白质-蛋白质相互作用中起作用[3]。由于可以同时与DNA和蛋白质相互作用的双重功能，bHLH转录因子对于植物生长调节和应激反应都非常重要，如葡萄VvbHLH1在拟南芥中的过量表达可以增强干旱和耐盐性[4]。来自刚毛柽柳的bHLH基因过表达可以通过增强渗透势和减少活性氧的积累来提高植物耐盐性和耐旱性[5]。棉花中GhbHLH171过量表达通过激活茉莉酸(JA)合成提高植物对真菌V.dahlia的耐受性[6]。

山药(Dioscoreaerhizoma)是典型的药食两用植物，深受人们喜爱，广泛引起世人关注，多年来人们不断对其营养价值、药用价值进行探索[7]。近年来，借助高通量测序及分子生物学技术，山药中有多个基因被克隆，并初步分析了其在块茎发育中的作用[8-10]，然而山药中具有抗逆功能相关基因的研究还比较少。目前植物bHLH基因家族已开展了广泛的鉴定及功能分析，而山药中该研究未见报道。本研究在全基因组水平鉴定山药bHLH基因家族，通过生物信息学及基因表达分析，揭示山药bHLH基因的结构及进化特点，及其对不同逆境胁迫的响应功能。

1 材料与方法

1.1 山药bHLH基因家族成员鉴定

山药基因组信息在GenBank (http: //www. ncbi. nim.nih. gov /genbank/)数据库中下载。以bHLH结构域(PF00010)为查询序列，利用HMMER 3.0软件对山药蛋白组数据进行搜索，获得山药bHLH家族蛋白序列，用保守结构域进行验证，剔除不具备保守结构的序列，并根据染色体定位进行重新命名。使用ExPaSy数据库(http://www.expasy.org/tools/)进行山药bHLH的蛋白理化性质分析。

1.2 山药bHLH基因家族系统进化分析

使用Clustalx软件进行蛋白序列比对，MEGA 7软件构建ML系统发育树。

1.3 保守基序及基因结构分析

用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)预测蛋白保守基序。用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因外显子-内含子模式图。

1.4 染色体定位分析

根据基因信息通过Mapinspect软件绘制染色体定位图。

1.5 三维结构分析

用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白三维结构模型。

1.6 基因表达分析

分别取山药根、匍匐茎和叶提取RNA，作为器官表达分析样本。用体积分数20% PEG 6000 溶液(模拟渗透胁迫)，200 mmol/L NaCl 溶液(模拟盐胁迫)分别喷施3月龄山药叶片，12 h 后取叶片提取样本总RNA并反转录作为胁迫处理表达分析样本。以网格蛋白重链基因(clathrin heavy chain,CHC)作内参基因，引物CHC-F:5’-GGTGAACTGTATGAGGCGG-3’，CHC-R:5’-GCA-

TCCACACAAGCAAAGCA-3’。山药bHLH5基因表达引物bHLH5-F: 5’-AACCAGCACGCACAAATACAC-3’，bHLH5-R:5’-TCAGATTCTGCAAAGCCTTCA-3’。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量，3次重复做统计学分析。

2 结果与分析

2.1 山药bHLH转录因子家族鉴定

利用HMMER3.0软件比对，并通过Pfam和SMART验证保守结构域，最后鉴定得到67个山药bHLH基因。根据bHLH基因在染色体上的位置重新命名为bHLH01到bHLH67。

山药bHLH成员蛋白序列理化性质分析显示，该家族氨基酸数目介于146 (DrbHLH65)至1097(DrbHLH22)之间，分子量大小为15.82(DrbHLH65)～121.52 kD(DrbHLH22)，等电点为4.77 (DrbHLH24)～10.06(DrbHLH65)。蛋白质亲疏水性分析表明，山药bHLH家族蛋白属于亲水蛋白(表1)。

表1 山药bHLH基因家族理化性质分析Tab. 1 Physicochemical properties of yam bHLH gene family

续表1

2.2 山药bHLH家族系统进化分析

对山药和拟南芥bHLH蛋白序列进行比对，并构建ML系统发育树(图1)。拟南芥bHLH 家族有21组[11]，山药 bHLH 分为 17 组，没有成员对应拟南芥2、12、13和16组。其中成员数最多的是 15 组，有10 个成员，而第 21 组只包含一个山药bHLH成员。根据系统发育分析还鉴定了山药和拟南芥中的一些bHLH直系同源物，表明在这些植物物种分化之前存在一些祖先的 bHLH基因。

图1 山药和拟南芥bHLH蛋白系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of yam(Dr)and Arabidopsis thaliana (At) bHLH proteins

2.3 山药bHLH基因家族保守基序及基因结构分析

为了研究山药bHLH基因家族的进化关系，分析bHLH蛋白序列的保守基序及基因结构,结果见图2。

图2保守基序分析显示，虽然67个山药bHLH蛋白的保守基序在组成上存在差异，但都共同含有保守基序1，该基序是bHLH基因家族的保守结构。此外，同组成员中有相似的保守基序组成，可能与该家族中某些特殊的功能有关。基因结构分析结果显示只有5个基因(bHLH10、bHLH19、bHLH31、bHLH38 和bHLH57) 不具有内含子结构，其他bHLH基因均含有内含子结构，且内含子数目由1个(如bHLH47、bHLH60)到13个(bHLH8)不等。

2.4 山药bHLH基因家族染色体定位

染色体定位分析显示山药67个bHLH基因除19、21号染色体外，分布在剩下的19条染色体上。其中在2号、7号、9号和20号染色体上只有1个成员；在8号染色体上分布较多，有11个成员。其他染色体上则有3～5个成员(图3)。此外，1、4、8、13、16、18号染色体上有2个或多个基因的基因簇存在，可能是基因串联复制的结果。

图3 山药bHLH基因家族染色体定位图Fig. 3 Chromosomal location map of yam bHLH gene family

2.5 山药bHLH蛋白三维结构分析

随机挑选3个蛋白(DrbHLH5，DrbHLH50与DrbHLH65)进行蛋白三维结构分析。图4显示3个蛋白均包含螺旋-环-螺旋结构，都包含4个螺旋，螺旋中间有至少2个环进行连接，该结构符合bHLH蛋白螺旋-环-螺旋结构模型。

图4 山药DrbHLH5、DrbHLH50与DrbHLH65蛋白三维结构模型Fig. 4 3D-structure of DrbHLH5, DrbHLH50 and DrbHLH65 proteins

2.6 山药bHLH基因表达分析

为了分析bHLH基因潜在的功能，克隆得到了山药DrbHLH5基因，该基因1 068 bp，编码含355个氨基酸的蛋白。用qRT-PCR技术分析DrbHLH5基因表达模式。组织表达以山药根中表达量设为1，其他器官以相对表达量显示倍数差异，bHLH5在检测的多个组织中都有表达，其中叶中表达量相对较高(图5)。胁迫处理表达中以未做胁迫处理的空白对照表达量设为1，其他胁迫处理以相对表达量显示，结果表明bHLH5在渗透胁迫下上调4倍以上，盐胁迫处理下上调6倍左右(图6)，暗示该基因可以响应渗透胁迫和盐胁迫，可能具有潜在的抗逆功能。

图5 山药bHLH5在不同器官中的表达Fig. 5 Gene relative expression of bHLH5 in different organs

图6 山药bHLH5在不同胁迫处理下的基因表达Fig. 6 Gene relative expression of bHLH5 under different stress treatments

3 讨论

bHLH基因家族是一类重要的转录因子家族，因含有保守的螺旋-环-螺旋结构域而命名。植物bHLH基因家族成员数量多，许多已经被鉴定。拟南芥和水稻分别有162和167个bHLH基因[12]。大豆、马尾松中分别鉴定出340个和64个bHLH基因[13-14]。

理化性质分析山药bHLH基因家族蛋白都属于亲水蛋白，并具备bHLH保守结构基序，符合bHLH转录因子的特征[1-2]。通过与拟南芥对比分析系统进化关系，可将山药bHLH基因家族成员分为17个组，同一组内的成员大都具有相同的基因结构和保守基序，且bHLH基因内含子数量差异较大，基因在染色体上的分布也不均匀，说明山药bHLH基因家族进化较为保守，基因簇可能源于串联基因复制事件，且同组中有相似的结构，暗示可能与特定的功能有关。此结果与甜橙bHLH基因家族分析结果相似[15]。

目前植物bHLH基因家族广泛参与植物的多种生理活动，在生长发育、逆境胁迫响应等方面具有重要的调控功能。甘蓝BobHLH18基因在叶片高表达，且受冷胁迫诱导，可能在甘蓝叶片应答冷胁迫过程中起重要作用[16]。毛竹bHLH基因家族在干旱胁迫下有14个基因表达上调，盐胁迫处理后有13个基因的表达量上调，表明其可能在逆境胁迫响应中发挥作用[17]。本研究克隆得到山药bHLH5，基因表达显示其在山药根、茎、叶中均有表达，且在渗透和高盐胁迫下显著上调，表明该基因可能具有抗非生物逆境胁迫的功能。该结果为下一步基因功能分析提供基础。

4 结论

由于山药的基因功能研究起步较晚，目前，山药bHLH基因家族成员的功能研究还很欠缺。本研究分析了鉴定了67个山药bHLH基因家族成员，均属于亲水蛋白，三维结构分析表明该家族成员具有典型的螺旋-环-螺旋结构，与其他植物中bHLH的结构特征相符。67个bHLH基因可分为17组，同组的成员趋于拥有相同的保守基序和基因结构，且基因在染色体上的分布不均匀，有些以基因簇存在。基因表达显示山药bHLH5基因可响应干旱和盐胁迫，下一步可以深入研究该基因的抗逆功能。研究结果为该基因家族的功能解析提供参考，对利用bHLH基因研究山药基因功能，从而提高抗逆性及品质改良提供依据。