基于DNA-AuNCs内滤效应诱导荧光猝灭灵敏检测4-硝基苯酚

王海波，陶贝贝，吴宁宁，毛安丽，张红定

(信阳师范学院 化学化工学院/信阳市功能纳米材料生物分析重点实验室, 河南 信阳 464000)

0 引言

4-硝基苯酚(4-NP)是一种重要的硝基芳香化合物，已被广泛应用于农药、炸药、染料和制药工业等领域。然而，4-NP也是一种难降解的环境污染物和有害废物，对人类健康会造成严重威胁，引发恶心、头痛、高铁血红蛋白血症、肾脏和肝脏损害等多种疾病。由于4-NP的毒性和潜在致癌性，美国环境保护署已将其列入“优先污染物清单”，并限定饮用水中最大允许浓度为0.43 μmol/L[1]。此外，它已被确定为危险的食物链污染物，可以残留在农作物、蔬菜、水果中。由于其稳定性高、生物降解性差，去除污染的废水和土壤中的4-NP仍然非常困难。因此，开发一种快速、高灵敏的4-NP检测方法显得至关重要。目前，许多分析方法已用于4-NP含量的检测，如分光光度法[2]、毛细管电泳法[3]、电化学方法[4]、化学发光法[5]。但是，其中绝大部分方法处理时间长，需要昂贵的仪器设备和复杂的操作程序。相比之下，荧光分析方法具有样品预处理简单、成本低、灵敏度高等优点，为4-NP的检测提供了新的思路[6-8]。然而，大多数荧光方法是基于电子转移(ET)或Förster共振能量转移(FRET)诱导荧光猝灭机制[9-10]。为了实现对4-NP的灵敏检测，需对荧光供体(荧光基团)和受体(4-NP)进行表面修饰和化学偶联，其中ET或FRET诱导的荧光猝灭效率依赖于供体和受体之间的距离。此外，4-NP的同分异构体(2-NP和3-NP)由于化学结构相同，所以会对4-NP的选择性检测造成干扰。

基于内滤效应(IFE)诱导荧光猝灭构建的传感方法,具有操作简单、灵活等优点，而且吸收体和荧光团之间不需要任何表面改性和共价连接。只要选择适当的吸收体和荧光基团，当吸收体的吸收光谱与荧光基团的激发光谱或发射光谱重叠时，IFE就可以有效地发生[11]。YANG等[7]以锆基金属有机骨架合成的碳点作为荧光探针，基于IFE实现了4-NP含量的灵敏检测。ZHANG等[12]以蜡样芽孢杆菌为唯一碳源，制备了荧光碳点，基于IFE用于4-NP的含量测定。但是，荧光碳点的合成过程繁杂，费时费力。荧光金属纳米团簇作为一类新型的发光纳米材料，具有毒性低、成本低、生物相容性好、发光性能优异等优点[13-15]。DNA-AuNCs通过热辅助还原方法快速合成，并且具有较强的荧光强度和较高的光稳定性。WANG等[15]利用DNA-AuNCs构建了信号减弱型荧光传感方法灵敏检测胰蛋白酶活性。然而，利用DNA-AuNCs内滤效应构建荧光方法的报道较少。

本文以DNA-AuNCs作为信号报告探针，设计了一种内滤效应诱导荧光猝灭的传感新方法，用于灵敏检测4-NP。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

4-NP、氯金酸(HAuCl4·3H2O)、柠檬酸钠等试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。A30 DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列为：AAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA。

荧光激发光谱和发射光谱采用荧光分光光度计(F7000，日本日立公司)进行测量。荧光激发波长设置为290 nm，激发狭缝和发射狭缝均设置为5 nm。紫外吸收光谱采用紫外-可见-近红外分光光度计(UH4150，日本日立公司)进行测量，扫描范围设置为200～600 nm。样品池为石英比色皿，光程长为10 mm。

1.2 DNA-AuNCs的制备

DNA-AuNCs的制备采用热辅助还原方法，以氯金酸作为原料，A30 DNA作为合成模板，柠檬酸钠作为还原剂。首先，于1.5 mL离心管中，加入100 μL A30 DNA(2 μmol/L)、100 μL柠檬酸钠(50 mmol/L，pH=6.0)、60 μL HAuCl4(1 mmol/L)和740 μL超纯水，混合均匀。然后，将溶液置于90 ℃下孵育30 min，最后冷却至室温，即得到DNA-AuNCs，置于暗处4 ℃保存备用。

1.3 4-NP的检测

准确移取20 μL DNA-AuNCs、20 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.0)、10 μL不同浓度的4-NP、50 μL超纯水，混合均匀，室温下孵育5 min，然后进行荧光光谱测量。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

基于DNA-AuNCs内滤效应诱导荧光猝灭传感新方法的原理如图1所示。

图1 基于DNA-AuNCs内滤效应诱导荧光猝灭的传感新方法原理图Fig. 1 Schematic illustration for the DNA-AuNCs inner filter effect induced fluorescence quenching based novel fluorescent method

所制备的DNA-AuNCs在290 nm激发波长激发下，其最大发射波长为475 nm。4-NP在300～500 nm处具有较强的吸收，最大吸收峰位于400 nm。因此，4-NP的紫外吸收光谱与DNA-AuNCs荧光激发光谱和发射光谱均有部分重叠，发生内滤效应，导致DNA-AuNCs的荧光信号被显著地猝灭。通过荧光信号的变化，可以实现4-NP的定量检测。

2.2 DNA-AuNCs的表征

DNA-AuNCs的形貌尺寸通过透射电子显微镜(TEM)来进行表征。如图2所示，DNA-AuNCs的形貌接近于球形，其尺寸为3.2±0.6 nm。图3为DNA-AuNCs的荧光激发光谱(曲线a)、荧光发射光谱(曲线b)以及4-NP的紫外吸收光谱(曲线c)。DNA-AuNCs的最大激发波长为290 nm，最大发射波长为475 nm。4-NP的最大吸收峰为400 nm。4-NP的紫外吸收光谱与DNA-AuNCs荧光激发光谱和发射光谱均有部分重叠，能够发生内滤效应。

图2 DNA-AuNCs的TEM图Fig. 2 TEM image of DNA-AuNCs

图3 DNA-AuNCs的荧光激发光谱图(a)和荧光发射光谱图(b)、4-NP的紫外吸收光谱图(c)Fig. 3 Fluorescence excitation (a) and emission spectra(b) of DNA-AuNCs, and UV-vis absorption spectrum(c) of 4-NP

2.3 荧光方法的可行性

考察了DNA-AuNCs在不同条件下的荧光发射光谱图，进一步验证该方法的可行性。实验结果表明，加入200 μmol/L 4-NP后，DNA-AuNCs的475 nm处荧光强度显著降低，该荧光方法可以用于对4-NP的检测。

2.4 实验条件的优化

考察了缓冲溶液的pH值和4-NP孵育时间对荧光强度的影响，结果如图4所示。4-NP存在时，DNA-AuNCs的荧光强度显著降低，当pH值为7.0时， 475 nm处荧光强度的差值最大。而且，一旦4-NP存在，荧光信号就显著降低。

图4 不存在(a)和存在(b)4-NP时，pH值对DNA-AuNCs荧光强度的影响Fig. 4 The effect of pH value on the FL intensity of DNA-AuNCs in the absence(a) and presence(b) of 4-NP

2.5 荧光方法定量检测4-NP

在上述优化的条件下，向DNA-AuNCs溶液中加入不同浓度的4-NP，构建荧光传感平台。如图5A所示，随着4-NP浓度从0 μmol/L增加到600 μmol/L(0、1、10、20、30、50、60、80、100、150、200、400、500、600 μmol/L)，DNA-AuNCs的荧光强度逐渐降低。图5B给出了荧光响应(F0-F，其中F0为无4-NP存在时的荧光响应，F为有4-NP存在时的荧光响应)与4-NP的浓度(C，μmol/L)的相互关系。当4-NP的浓度为1～80 μmol/L时，F0-F与C呈现良好的线性关系，其线性方程为F0-F=4.350 6+1.582 2C，相关性系数R=0.990 6，检出限为0.3 μmol/L(RSN=3)。

图5 不同浓度4-NP对应的荧光发射光谱图(A)和浓度校准曲线(B)Fig. 5 Fluorescence emission spectra (A) of DNA-AuNCs in the presence of different concentrations of 4-NP and the calibration curve (B)

2.6 选择性考察

2-硝基苯酚(2-NP)、3-硝基苯酚(3-NP)、抗坏血酸(AA)、EDTA、K+、Na+、Ca2+、Mg2+等作为潜在的干扰物质来评估该传感方法检测4-NP的选择性。如图6所示，只有4-NP能够导致DNA-AuNCs荧光信号显著降低，这是由于4-NP的紫外吸收光谱与DNA-AuNCs荧光激发光谱和发射光谱均有重叠，发生内滤效应。其他干扰物质(包括2-NP、3-NP)对DNA-AuNCs的荧光强度无显著影响。结果表明，基于DNA-AuNCs内滤效应诱导荧光猝灭的传感新方法检测4-NP具有良好的选择性。

图6 传感方法的选择性考察Fig. 6 The selectivity of fluorescent method

2.7 实际样品分析

将构建的传感方法应用于湖水样品中4-NP含量的测定。湖水样品经过离心(15 000 r/min)处理，收集上层清液。采用标准加入法对湖水样品进行测定，检测结果如表1所示，其加标回收率为97.3%～102.8%，3次平行测定的相对标准偏差(RSD)不超过4.0%，表明该方法可以应用于实际样品中的4-NP含量的测定。

表1 湖水样品中4-NP含量的测定结果Tab. 1 Detection results of 4-NP content in lake water samples

3 结论

本文提出了一种基于DNA-AuNCs内滤效应诱导荧光猝灭的荧光传感新方法，实现了高灵敏度和高选择性检测4-NP。该方法依赖于4-NP的紫外吸收光谱。该光谱与DNA-AuNCs荧光激发光谱和发射光谱均有重叠，发生内滤效应，导致DNA-AuNCs的荧光信号显著猝灭。这一方法在环境监测等领域具有潜在的应用价值。