人富血小板血浆试管法人工制备及保存的研究进展

李梦婕，陈宁杰，王海涛,

（1.滨州医学院第二临床医学院，山东 烟台，264100；2.山东大学附属威海市立医院，山东 威海，264200）

富血小板血浆（Platelet‐rich Plasma,PRP）是一种血小板浓度高于生理浓度的浓缩物，其激活后释放的生长因子、细胞因子等多种生物活性物质能够促进细胞增殖及组织愈合，在组织修复上具有独特优势。目前PRP已在烧（创）伤、慢性难愈性创面、运动性损伤等多种与组织损伤修复相关的疾病中应用，与单独使用重组生长因子相比，其疗效毋庸置疑，且近年来开始越来越多的应用到医疗美容领域如面部年轻化、秃发等的预防及治疗中[1,2]。研究发现PRP疗效与血小板浓度、活性等多种因素相关，而PRP中血小板浓度和活性受制备方法的影响。PRP常用的制备方法包括试管手工法、机采法、套装法和血袋法等，但目前尚无统一的标准化制备方案，制备过程中的血液条件、抗凝剂、离心参数等多个方面均可对最后的成品产生影响，进而影响其疗效[1‐5]。同时，运用标准方法制备一定量的PRP进行保存，再根据治疗量取用可能是保证其疗效均一的可行性方法。本文就PRP的试管手工法制备、保存进行探讨，以期为本领域研究者的工作中提供一定的理论基础。

1 分 类

作为由血液制备而成的高血小板浓度血浆浓缩物，PRP常通过采集患者自体静脉血制备。根据离心浓缩后产物中的白细胞含量分为纯富血小板血浆（pure platelet‐rich plasma，P‐PRP）和富白细胞富血小板血浆(leukocyte and platelet‐rich plasma，L‐PRP)[3]。临床医生在实际操作过程中往往根据不同的治疗需求进行选择。

2 试管手工法PRP 的制备原理及方法

PRP最终产量和质量与血液状态、性别、身高等自身条件，及抽血量、制备方法、离心策略等操作因素均相关。采血量根据用途不同而有所差异，单管采血量可以在8～60mL不等，所得PRP最终体积可根据所需血小板浓度，通过生理盐水或贫血小板血浆（platelet‐poor plasma，PPP）进行调节，一般约为抽血量的1/5～1/10[4,5]。国际细胞医学会提出PRP的血小板浓度有低倍(2.5～3.0倍)和高倍(5～9倍)之分；国内学者普遍认为在临床应用时，PRP中的血小板浓度应以4～8倍为宜[1‐2,6]。

PRP主要制备方法包括血袋采集制备法、专用分离套装制备法、试管手工采集法、成分血细胞单采机采集制备法等。前三种制备方法的原理基本相同，为基于二次差速离心法的血细胞分离[2]，是目前最常采用的方法，利用全血中各血液成分不同的沉降率和比重将不同血液成分进行分离，其中血小板比重及密度在血细胞中最低，仅略高于血浆。第一次低速离心也称为软离心，离心后血液被分为三层，底层为红细胞层，约占总体积的一半；中间很薄的浅棕色层为泛白层(buffy coat)，含有血小板和大量白细胞，上层为血浆层[3,7]。不同位置的血浆中血小板浓度和平均血小板体积差异较大[8]，离心后约半数的血小板在泛白层中，下1/3血浆及泛白层中的血小板数量可超过全血的80%[5]。在保证血小板损失量最小的情况下去除底部红细胞后进行第二次高速离心，也称为硬离心，以进一步缩小产物体积、浓缩血小板，从而获得较高的血小板回收率及最佳的血小板产量和质量。硬离心后血小板和残留的红细胞下沉到容器底部，上层为PPP，去除上层多余的PPP，将剩余部分混匀即为PRP[4,9]。

也有学者根据所保留成分的不同将第二次离心细分为纯富血小板血浆法（贫白细胞富血小板血浆）和泛白层法（富白细胞血小板血浆）。纯富血小板血浆法是从试管中只分离出上层血浆层进行硬离心，不干扰泛白层或红细胞层，但因泛白层中也含有血小板，该方法在减少白细胞含量的同时会损失一定量血小板。泛白层法是指软离心后收集上层血浆层和全部的泛白层进行硬离心[5]。

3 影响PRP 制备效果的因素

血小板在激活后能释放大量生长因子，因此，PRP中血小板数量、血小板回收率等是评价制备方法经常考虑的问题。不同个体可能需要不同的血小板浓度比来达到相似的效果，且血小板中含有的生长因子浓度在不同患者之间也存在差异。PRP制备过程受控于多个因素：

3.1 离心参数

很多研究者就二次离心的PRP制备方法进行了探索，根据需求、环境及设备等不同，在保持基本原理不变的前提下选用不同离心参数，见表1。

3.1.1 第一次离心

不同离心机的转子大小和半径有所差异，描述时通常会用相对离心力（relative centrifugal force，RCF）来表达。其公式为：

当全血体积和离心时间固定时，血小板和白细胞的回收率随着离心力的增加逐渐增加达到峰值，而后过大的离心力可能会对细胞造成破坏从而使回收率逐渐下降，全血体积越大这种下降趋势越不明显。第一次离心以后上层血浆的体积会随着离心力的增大而增加，在一定离心力区间内，血小板回收率与第一次离心后上层血浆的获取率成正相关[11‐13]。

Ozer等人[14]发现无论实验中选取的离心力高低，最终都能达到想要的血小板浓度；当离心力较大时，离心时间应尽量短，反之亦然。第一次的离心参数范围通常在70～900×g，5～10min之间，此时血小板的回收率较高且白细胞含量少，同时不会对血小板造成破坏[15]。Muthuprabakaran等[5]发现离心力越大，泛白层中所含的血小板就越多,Perez[12]认为在相同的离心条件下单管处理较少的血容量可以更有利于血小板的回收，而离心时间可以作为一个调控PRP中白细胞水平的参数，离心时间长，白细胞浓度会降低。Araki[15]等认为如需较高的白细胞含量，离心力可控制在70×g。Amable等[7]指出当离心时间较短时，不同温度对最终产物无明显影响。

3.1.2 第二次离心

第二次离心时血小板回收率同样会随离心力的增加逐渐增高，但长时间高速离心可能因破坏血小板细胞膜而影响生长因子释放[12]。研究者们认为第二次离心参数最佳设定范围在400～1500×g，10～17min之间，该范围内所得PRP的血小板浓度和回收率较高且几乎不含其他细胞[8,16]。张昭远等[11]认为离心后泛白层中的血小板浓度能达到全血的20～40倍以上，Perez等[12]将第二次离心时离心时间设为10min，发现当离心力超过400×g时，PPP中残留血小板较少，当离心力超过800×g时，血小板膜的完整性会遭到破坏从而使血小板被激活，且离心后沉淀在底部的少量红细胞能吸附约20%的血小板使其不能很好的重悬。Bausset等人[17]则认为第二次离心力在250×g以上都能得到较好的血小板浓度，但离心力的增加会导致血小板会发生自发性聚集使重悬程度降低，静息血小板形态变差，这与Perez的观点基本一致。

3.2 抗凝剂的选择

血小板的抗凝状态通过拮抗钙离子实现，在不激活PRP的前提下，其在制备后能够形成稳定的抗凝状态约8h[18]。常用抗凝剂包括枸橼酸类、乙二胺四乙酸（EDTA）及肝素[19]。除肝素是通过抗凝血酶作用外，其余抗凝剂均通过一定程度的螯合钙离子而发挥抗凝作（表2）用[16]。

表2 不同抗凝剂的作用机制

枸橼酸钠（sodium citrate,SC）是枸橼酸类抗凝剂中常用的一种，6mg枸橼酸钠能抗凝1mL血液，在制备PRP时通常选用3.2%的枸橼酸钠按照1:9的比例与全血进行混合，该比例也适用于其他抗凝剂[16]。枸橼酸钠‐葡萄糖溶液（acid citrate dextrose，ACD）作为制备PRP常用的抗凝剂之一，能在制备过程中更好地维持血小板内信号转导机制，从而提高了血小板的整体反应性[17]；使用ACD作为抗凝剂并以较低的离心力离心能够一定程度上保护血小板膜的完整性[3]。非聚集血小板的保存对于最大限度地提高血小板和血小板各类因子的浓度也至关重要，EDTA作为一种钙螯合剂，与ACD相比作用更强；在防止血液凝固和血小板聚集方面明显优于枸橼酸类抗凝剂，能使PRP中的血小板产量更高[15]。但有研究认为EDTA做抗凝剂虽然能够使血小板产量达到枸橼酸盐类抗凝剂的2倍，却会造成血小板的完整性受损[20]，Aizawa等[21]也有类似观点，认为ACD对血小板的大小和功能，包括血小板的激活和生长因子的保留，优于其他的抗凝剂。不过Aizawa也表示EDTA能够制作出悬浮较好的PRP，在保留部分生长因子浓度的方面与ACD相似，因此如果能将EDTA剂量维持在对局部其他细胞组织无毒性的条件下，可作为ACD的替代品。

血小板在肝素抗凝环境中随着时间延长会更易聚集[22]，且肝素在对PRP质量控制和凝血活性恢复方面不能得到很好地控制，因此不适合用于PRP制备[21]。

3.3 红细胞、血小板压积及其数量对制备PRP 的影响

红细胞压积可影响PRP的质量，其百分比越高，PRP中血小板数量越多；每增加1%的红细胞压积，PRP中的血小板计数约增加40×103/μL[19,23]。血小板压积为血小板总数与平均血小板体积的乘积，机体调节过程中倾向于保持血小板压积而不是数量的均衡，因此其也可作为评价PRP质量的因素之一。此外，基础血小板总数每增加1×103/μL，PRP中增加4.98×103血小板/μL[8]。

每个人全血的血小板数和浓度皆不相同，仅用血小板浓度及基线倍数来对PRP进行标定时，同样方法所得的产物会有很大差异。Tian等[16]设计了一种能够通过公式来准确控制血小板计数来控制最终PRP中血小板浓度的标准化PRP制备方法。首先估算第二次离心后保留的PRP体积(mL)：

PRP(mL)=[取血量(mL)×设定血小板回收率%×全血血小板浓度(109/L)÷(1000×109/L)；

将通过公式计算制得的PRP混匀后，如果血小板浓度大于1000×109/L，则再次利用公式计算出用来稀释的PPP体积：

加入PPP体积(mL)=第二次离心后保留PRP(mL)×[第二次离心后血小板浓度(109/L)÷(1000×109/L)‐1]。

3.4 其他

身高可能是影响PRP质量的因素之一，身高越高的人PRP中血小板浓度越大[19]，性别也是一个可能影响PRP质量的因素[6]。此外，虽然全血制备前的保存温度和制备时的温度会对PRP质量产生一定影响，但这种影响并不大[11]。

4 PRP 的不同保存方法及其效果

4.1 PRP 的低温保存

Caiado等[26]将L‐PRP在‐30～‐20℃下进行三次重复的冻融循环后在至少‐20℃的等离子冰箱中低温保存，解冻后应用并通过进一步检测其成分发现该保存方法至少可以保存PRP一年而不会对其质量造成明显破坏。Kim等[24]将PRP分别置于三种不同温度下（室温24℃，冷藏4℃，及低温冷冻‐70℃），保存0～7d后对其进行激活并在37℃下孵育一小时后分析发现，储存的PRP中生长因子浓度受储存时间、储存温度及体外激活方式影响明显，其中血小板计数和碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor‐basic,FGF‐B)浓度受解冻过程的影响很大。低温保存1d后检测，血小板计数显著下降而FGF‐B浓度显著升高，这可能与解冻过程中的细胞裂解有关系。而对于其他的生长因子而言，在7d的检测范围之内，并没有观察到储存温度对生长因子浓度有明显的影响。

Kaux等[27]通过两次冻融循环（‐80℃，10min及37℃，5min）制备冻融PRP，并在两周期之间进行15s的均质处理，后在2000×g、5min的参数下离心去除膜碎片并在1h之内应用；结果表明冷冻PRP与新鲜PRP对组织的愈合一样有效，但新鲜PRP治疗速度略快。同时由于冻融后的细胞裂解和血小板脱颗粒，冻融PRP的部分生长因子含量较新鲜PRP有显著增高，这也与Kim的观点相一致。Kikuchi等[28]则发现被氯化钙激活后冻存的样本相比于先冻融再激活的样本有较高的生长因子浓度。

此外，在冷冻5～7d以后，细胞的氧化应激反应能够造成血小板的损伤，因此Hedge等也表示可以适当应用抗氧化剂以保护血小板不被清除[29]。

4.2 PRP 的冻干

da Silva等[30]人在‐80℃下对PRP进行冷冻后干燥处理并在‐20℃下保存，观察冻干PRP再复温后血小板的活性，发现新鲜PRP和冻干PRP在释放生长因子的水平及生长因子的功能上并没有明显的统计学差异，证明了冻干PRP在临床应用中代替新鲜制备PRP的一种可能性。Kinoshita等[31]将PRP冻干4周后重悬检测，冻干PRP在4周后仍能保留部分生长因子活性。Huber等[32]发现冻干PRP虽然破坏了其中40%～90%的血小板，但是生长因子的含量较新鲜PRP有明显倍数增加。

冻干PRP的复水化可以通过PPP进行；生理盐水、超纯水和PBS缓冲液也可代替PPP作为冻干PRP的复水液，且在对生长因子的影响上无明显差异，但使用超纯水复水化后会有较多絮状物且快速形成凝胶[33]。

5 结语

综上，试管手工制备法大多是在二次离心法的原理基础上，结合已有文献自行选择离心参数进行制备，区别主要在于离心力和离心时间的差异上；同时，手工提取时也可通过白膜层控制是否需要留存白细胞。PRP目前已在整形美容及再生医学的多个领域中应用，例如毛发再生、面部年轻化、面部填充等，但不同制备方法后，PRP中各有效成分含量对治疗效果的影响、白细胞含量是否影响治疗结局等方面研究仍旧较少。目前在临床应用中，大多数医生更倾向于临床使用新鲜制作的PRP，但PRP受制于全程制备耗时较长、制备套装价格昂贵等因素影响，应用上仍存在一定限制。因此，探索不同的成分对实际应用中结局的影响，合理、安全且有效的短期保存方法等方向仍可作为未来的重点。

利益冲突：所有作者声明，在文章撰写过程中不存在利益冲突。