沙格列汀干预非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病大鼠肝组织AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路蛋白表达变化*

汪晓燕，钟雪玉，吴春燕

沙格列汀是临床常用的治疗2型糖尿病(T2DM)的药物，可通过选择性地抑制二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DDP4)，调节胰岛素分泌，发挥控制血糖的作用[1-4]，也被最新的研究证实有较好的控制血脂和肝功能保护作用[5]，但目前尚不清楚其具体的作用机制。腺苷酸5-单磷酸活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)-转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)信号通路是与细胞自噬有关的通路，可调节机体糖、脂代谢过程，参与介导多种肝脏疾病的发生和发展[6]。本研究应用沙格列汀干预非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)合并T2DM大鼠，观察了其对AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路的影响，以探讨其治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 42只清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体质量为160±20 g。饲养于武汉大学动物实验中心，保持26℃恒温、60%空气湿度、12 h亮光/12 h暗光循环光照条件，给予充足的饮水和食物，保持饲养笼干净、卫生。

1.2 NAFLD合并2型糖尿病动物模型的构建 采用随机数字表法将42只大鼠随机分为对照组、模型组和沙格列汀干预组，每组14只。给予模型组和沙格列汀干预组大鼠高脂饲料(普通饲料/15%猪油/10%蔗糖/2%胆固醇/0.25胆酸)喂养，而对照组动物继续接受普通饲料喂养。持续喂养10 w。禁食12 h，随机处死2只大鼠，称体质量，取血清和肝组织检查，确定NAFLD大鼠模型构建成功[7]。接着，各组大鼠禁食12 h，给予模型组和沙格列汀干预组链脲佐菌素(上海吉至生化科技有限公司)30 mg.kg-1腹腔注射，以制备2型糖尿病模型，给予对照组腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，经尾静脉取血0.5 mL，检测血糖和血脂水平。当血糖水平大于11.2 mmol/L时，视为2型糖尿病模型构建成功[8]。在造模成功后，在沙格列汀处理组12只大鼠，给予沙格列汀(阿斯利康制药有限公司)10 mg.kg-1·d-1持续灌胃8 w，在对照组12只和模型组12只大鼠，给予等量的生理盐水灌胃处理，持续8 w。在实验结束时，称质量，采取颈椎脱臼法处死大鼠，经腹主动脉取血，取肝脏，称质量，按照肝湿质量/大鼠体质量)×100%计算肝脏指数。取肝组织，用4%多聚甲醛固定，脱水透明封蜡后制片HE(上海歌凡生物科技有限公司)染色[9]，在奥林巴斯显微镜(济南欧莱博电子商务有限公司)下观察。

1.3 血清检测 采用放射免疫法检测空腹胰岛素(insulin，INS，上海信帆生物科技有限公司)；使用济南来宝医疗器械有限公司提供的BK-280型全自动生化分析仪检测空腹血糖[(fasting plasma glucose，FPG)，按照FPG×INS)/22.5计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)]和血生化指标。

1.4 肝组织AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路蛋白检测 采用Western bloting法检测肝组织AMPK、p-AMPK、mTOR、TFEB和自噬标记物LC3B-II蛋白表达。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理学表现 对照组大鼠肝组织结构清晰，肝细胞排列整齐，大小一致，无明显脂肪变性或细胞坏死；模型组大鼠肝组织结构模糊，细胞排列杂乱，可见小叶结构破坏，纤维组织增生，细胞内有大量的脂肪空泡存在；沙格列汀处理组肝组织较为完整，未观察到明显的小叶内纤维组织增生，脂肪变性程度也较模型组显著改善(图1)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现(HE，200×)

2.2 各组体质量、肝质量和肝脏指数比较 沙格列汀处理组大鼠体质量、肝质量和肝脏指数均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组体质量、肝质量和肝脏指数比较

2.3 各组大鼠血糖指标比较 沙格列汀处理组大鼠FPG、INS和HOMA-IR均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠血糖指标比较

2.4 各组大鼠血脂和肝功能指标比较 沙格列汀组大鼠TC、TG、ALT和AST水平均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 各组血脂和肝功能指标比较

2.5 各组大鼠肝组织AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路蛋白表达比较 沙格列汀处理组大鼠肝组织p-AMPK、TFEB和LC3B-II表达显著强于模型组，而mTOR表达显著弱于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表4、图2)。

表4 各组肝组织内AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路表达比较

图2 各组大鼠肝组织AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路蛋白表达变化

3 讨论

随着对NAFLD和T2DM研究的不断探索，发现多种因素参与机体糖代谢、炎症反应和胰岛素抵抗等生理病理过程[10-12]。沙格列汀被证实可显著改善机体胰岛素抵抗和炎症反应，减缓NAFLD合并T2DM患者疾病进展[13]。本研究以沙格列汀处理NAFLD合并T2DM大鼠，发现沙格列汀可显著降低模型大鼠血糖和血脂水平，保护肝脏功能。

营养性脂肪肝模型是现阶段国内外最常用的NAFLD大鼠模型的建模方案，具有成功率高、与临床发病机制相似以及适合观察药物干预效果等优点[14]。本研究采用高脂饮食和链脲佐菌素腹腔注射构建NAFLD合并T2DM大鼠模型，再以沙格列汀进行为期8周的灌胃干预，结果显示，沙格列汀可显著降低模型大鼠体质量、肝质量和肝脏指数，抑制大鼠血糖指标如FPG、INS和HOMA-IR，降低血脂水平。沙格列汀能提高内源性胰高血糖素样肽-1和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽水平[15]，作用于胰岛α和β细胞，抑制胰高血糖素的分泌，促进胰岛素的合成与释放，在有效降糖的同时缓解因高糖导致的胰岛素敏感性下降，加速新陈代谢，促进外周脂肪分解，降低了游离脂肪酸含量，阻止脂质沉积于肝组织[16]，发挥保护肝功能的作用。

AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路是与细胞自噬有关的经典通路。细胞自噬作为不同于凋亡的细胞死亡过程，通过清除破损的蛋白或细胞器维持细胞的完整性[17]。细胞自噬不仅参与调节多种恶性肿瘤的发生和发展，还与肝脏、骨骼肌和皮下脂肪等靶组织对于胰岛素反应的调节机制有关，能介导胰岛素抵抗引起的高糖损伤[18]。本研究结果发现，沙格列汀通过激活肝组织AMPK磷酸化水平，抑制下游分子mTOR表达，上调TFEB和自噬标记蛋白LC3B-II表达，抑制了NAFLD合并T2DM的疾病进展。NAFLD合并T2DM大鼠肝组织含有大量的非脂质碳源和脂质沉积，沙格列汀通过激活AMPK磷酸化水平，影响三磷酸腺苷酶合成和代谢，维持细胞能量的稳态平衡[19]，靶向并抑制其下游基因mTOR分子的活化，并作用于溶酶体内重要脂质调控因子TEFB，影响溶酶体对于亚细胞碎片的清除能力和自噬转录调控效应，使自噬标记蛋白由LC3I向LC3II转化，激活细胞自噬反应[20]，维持了脂质稳态平衡。