LncRNA HOXD-AS1在斑马鱼异种移植模型对肝细胞癌细胞增殖和迁移能力的影响*

张 缨，江龙委，秦 峰，贾绍昌

近年来，越来越多的研究者使用患者来源的斑马鱼异种移植(zebrafish patient derived xenograft，zPDX)研究肿瘤的发生[1-3]。一些zPDX 模型也成功建立[4，5]。与小鼠异种移植模型比，透明斑马鱼幼虫异种移植模型可以在活体内直接观察移植的癌细胞，能同时研究肿瘤的生长和迁移[1,6]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)严重威胁着人类健康，每年新发HCC病例约为80万例[7]。尽管已有各种新的治疗方法被用于治疗HCC患者，但总体生存率仍然很低[8]，主要是由于手术切除后肿瘤容易复发和迁移，导致HCC患者病死率居高不下[9]。长链非编码核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)是一类非编码转录物(>200 个核苷酸)[9]。越来越多的研究证明，lncRNA在多种生理和病理学过程中发挥着重要作用[10]，包括HCC细胞的生长、迁移和耐药过程[11]。近期研究表明，一些lncRNA在HCC细胞迁移过程中存在竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)机制[12-14]。同源异形基因D簇反义核糖核酸1 (HOXD cluster antisense RNA 1，HOXD-AS1，也被称为 HAGLR)是一种lncRNA，可以作为神经母细胞瘤进展的标志物[15]。它是人类染色体2q31.2上的HOXD簇以反义方式转录的，包含八个外显子[15]。已有研究证明，HOXD-AS1可以作为与miRNA结合的ceRNA在HCC、肺癌、卵巢癌、胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌、胆管癌和宫颈癌等多种癌症中发挥作用[15，16]。但是，这些研究都缺乏直观的体内证据，而zPDX可为lncRNA研究提供快速直观的癌症迁移模型[17]。我们尝试使用zPDX模型建立了lncRNA体内研究方法。

1 资料与方法

1.1 斑马鱼的养殖 将成年斑马鱼(南京歆佳医药科技有限公司)维持在 28℃鱼类自动培养系统(中国海神公司)。本研究使用了AB 野生型和Tg(fli1a:EGFP) 转基因斑马鱼。

1.2 细胞培养 采用HCC细胞系HepG2、Hep3B、Huh7和正常肝细胞系LO2细胞，所有细胞均于 2019年购自中国上海寸迈生物科技有限公司，均通过微卫星DNA(microsatellite DNA，STR)测试验证，经PCR法检测支原体阴性。

1.3 细胞RNA提取和qRT-PCR检测 常规提取细胞RNA，基因特异性引物的序列为，HOXD-AS1-F: 5′-ATTCGTCTGACTTGGCTCTT-3′；HOXD-AS1-R: 5′-CCTGTTTTGACCTTTTCCTG-3′；GAPDH-F:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′； GAPDH-R:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。

1.4 siRNA和miRNA抑制剂转染细胞 使用 Lipofectamine 3000试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)转染细胞特定的siRNA或miRNA抑制剂。我们从General Biosystems(中国)购买了两种HOXD-AS1 siRNA、miR-130a-3p抑制剂和阴性对照(negative control，NC)siRNA。HOXD-AS1 siRNA 序列如下[16]：si1-HOXD-AS1：5′-GAAAGAAGGACCAAAGTAA-3′；si2-HOXD-AS1：5′-GCACAAAGGAACAAGGAAA-3′；NC siRNA序列是 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.5 细胞增殖实验 使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，DOJINDO，日本)进行细胞增殖测定。

1.6 细胞侵袭试验 用HOXD-AS1和NC siRNA转染Hep3B和Huh7细胞。用Transwell法检测侵袭情况。

1.7 zPDX模型的建立 注射前，将肝癌细胞Hep3B和Huh7(中国上海寸迈公司)用荧光染料CM-DiI(Invitrogen，美国)标记。方案如下：收集细胞，用HBSS洗涤3次。将细胞用CM-DiI在37℃下标记5 min，再在4℃下标记15 min。用HBSS漂洗3次，去除未结合的染料，即制备好了标记的细胞。将标记的癌细胞注射到受精后48 h的斑马鱼幼虫的卵周间隙(perivitelline space，PVS)。将每条斑马鱼幼虫固定在1.2%低熔点凝胶中，通过微量注射器将约300～400个细胞植入PVS。注射后，将斑马鱼幼虫异种移植物在34℃培养至实验结束。在注射后1d，选择成功注射的具有相似肿瘤大小的异种移植物用于以下实验。

1.8 斑马鱼体内成像和定量分析 在注射后第4 d，将斑马鱼幼虫安装在1.2%低熔点凝胶中，通过立体显微镜(MVX10，Olympus，日本)或使用20×水浸物镜(Fluoview 3000，Olympus，日本)的共聚焦显微镜拍摄图像。图像的空间分辨率为1600×1200(MVX10)或1024×1024像素(Fluoview 3000)。应用ImageJ软件对图像进行定量分析。

2 结果

2.1 HCC细胞HOXD-AS1呈高水平 经qRT-PCR检测显示，HepG2、Hep3B 和 Huh7细胞HOXD-AS1水平分别显著高于LO2 细胞(65.6±5.7)、(4.6±0.5)和(23.4±1.0)倍(P<0.001)；在转染siRNA 24 h后，与NC细胞比，第一条siRNA(si1-HOXD-AS1)在HepG2、Hep3B和Huh7细胞对HOXD-AS1的敲减率分别为40.9%、96.6%和75.7%，第二条siRNA(si2-HOXD-AS1)的敲减率分别为3.9%、41.0% 和 45.2%。基于敲低效率数据，我们选择Hep3B和Huh7 细胞进行下一步研究。

2.2 敲低HOXD-AS1在体外和体内抑制Hep3B细胞增殖和迁移 在转染si1-HOXD-AS1后，Hep3B细胞增殖活性显著降低，而在转染si2-HOXD-AS1后细胞增殖水平并无显著变化(图1A)。经Transwell实验结果显示，敲低HOXD-AS1后Hep3B细胞每视野细胞数为49.6±3.9，显著低于对照组的221.8±63.3(P<0.01)，提示敲低HOXD-AS1后Hep3B细胞侵袭能力受到抑制(图1B)。在zPDX实验结果显示，代表细胞增殖的蛋黄CM-DiI阳性信号量化区域信号为对照组的56.0±12.0%(P<0.01)，提示敲低体内HOXD-AS1降低了Hep3B细胞的增殖能力(图1C～E)。代表迁移的躯干CM-DiI阳性信号为对照的49.0±8.9%(P<0.05)，提示在体内敲低HOXD-AS1也降低了Hep3B细胞的迁移(图1F～H)。

图1 敲低HOXD-AS1抑制Hep3B细胞增殖和迁移A：转染HOXD-AS1或NC siRNA后Hep3B细胞增殖；B：转染HOXD-AS1或NC siRNA后Hep3B细胞侵袭；C：经HOXD-AS1或NC siRNA转染的Hep3B细胞注射到2-dpf Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼幼虫的PVS；D：使用共聚焦显微镜以每英寸点数(dots per inch，dpi)拍摄蛋黄图像，显示量化蛋黄CM-DiI阳性区域增殖情况；E：C图和D图信号统计分析；F/G：使用共聚焦显微镜以4dpi拍摄躯干图像，量化躯干CM-DiI阳性区域的迁移情况(箭头代表一些迁移细胞。该区域的放大视图显示了典型的迁移细胞；H：F图和G图信号统计分析大小：100 μm。*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 敲低HOXD-AS1在体外和体内抑制Huh7细胞增殖和迁移 与Hep3B细胞实验相同，在Huh7细胞转染si1-HOXD-AS1后，仅在72 h细胞增殖活性降低，为对照组的68.2±15.4%(P<0.001)，其余时间点均无显著差异，但Transwell实验结果显示，敲低HOXD-AS1后Huh7细胞每视野细胞数为54.2±15.2，显著低于对照组的226.8±26.3(P<0.01)，提示敲低HOXD-AS1抑制了Huh7细胞的侵袭。在zPDX实验结果显示，代表细胞增殖的蛋黄CM-DiI阳性信号为对照组的46.5±16.8%(P<0.01)，提示在体内敲低HOXD-AS1降低了Huh7细胞增殖。代表迁移的躯干中CM-DiI阳性信号为对照组的41.9±10.2%(P<0.01)，提示在体内敲低HOXD-AS1也降低了Huh7细胞的迁移能力。

2.4 敲低miR-130a-3p可促进体外和体内HCC细胞迁移 为了进一步研究HOXD-AS1在HCC迁移过程中的作用，我们选择与其竞争性结合的miRNA之一miR-130a-3p进行验证。在miR-130a-3p被其抑制剂敲低后，Huh7细胞每视野细胞数为39.0±9.2，显著高于对照组的24.4±7.2(P<0.001)，提示Huh7细胞的侵袭能力显著增强(图2A)。将miR-130a-3p抑制剂转染的细胞移植到斑马鱼幼虫后，躯干CM-DiI阳性细胞也显著增多，为对照组的187.8±42.7%(P<0.05，图2B)。

图2 抑制miR-130a-3p提升Huh7细胞的迁移能力A:转染miR-130a-3p抑制剂或NC抑制剂后Huh7细胞侵袭能力变化；B：将经miR-130a-3p抑制剂或NC抑制剂转染的Huh7细胞注射到2-dpf Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼幼虫的PVS，量化躯干CM-DiI阳性区域的迁移情况大小：100 μm。*：P<0.05，***：P<0.01

2.5 敲低miR-130a-3p在Huh7细胞挽救因HOXD-AS1下调导致的细胞迁移能力下降 本研究将si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制剂共转染Huh7细胞，检测体内外细胞迁移能力。结果显示，共转染组、si1-HOXD-AS1组和NC组每视野细胞数分别为78.2±15.3、39.3±9.5、79.4±18.3，差异显著(P<0.01)，提示在体外敲低miR-130a-3p能挽救因HOXD-AS1下调导致的细胞迁移能力下降(图3A)。在zPDX中，si1-HOXD-AS1组和共转染组CM-DiI阳性细胞分别为NC组的48.9±13.5%(P<0.05)和109.4±24.9%(P>0.05，图3B)。

图3 抑制miR-130a-3p能挽救因HOXD-AS1下调导致的细胞迁移能力下降A：共转染si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制剂后Huh7细胞侵袭能力变化；B：在zPDX检测共转染si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制剂后Huh7细胞在体内的迁移能力大小：100 μm。*：P<0.05，**：P<0.01

3 讨论

在本研究，我们首先利用zPDX验证了HOXD-AS1在不同HCC细胞呈高水平。接着，在体外培养细胞和zPDX沉默HOXD-AS1基因，评估肝癌细胞增殖和侵袭能力，检测与HOXD-AS1竞争结合的miR-130a-3p在肿瘤迁移中的作用，我们发现抑制miR-130a-3p可以挽救肝癌细胞迁移，体外和体内敲低HOXD-AS1基因可降低肝癌细胞迁移，表明zPDX可能是一种可靠的人类癌症迁移实验模型[17]。

与小鼠模型比，zPDX在肿瘤生物学方面显示出更多的优势[18，19]。在移植后4天内，通过zPDX可以检测HOXD-AS1对细胞迁移的作用，而小鼠模型至少需要4周。本文主要研究肝癌细胞的迁移，也可分析细胞增殖。结合不同的转基因斑马鱼系，还可以研究肝癌细胞微环境，例如Tg(fli1a:EGFP)转基因系可以用于研究肿瘤血管生成。在本研究，我们发现了Hep3B和Huh7细胞之间的生长差异，因为Huh7细胞生长方式比Hep3B细胞更集中。

最近的研究表明，一些lncRNA，如ceRNA，可以通过与miRNA竞争性结合调节miRNA靶标水平，从而影响肿瘤的进展[20]。本文同样证实了敲低HOXD-AS1的ceRNA之一miR-130a-3p可以促进HCC细胞迁移，而敲低HOXD-AS1能抑制HCC细胞迁移。同时，敲低miR-130a-3p可以在体内外挽救因HOXD-AS1下调导致的细胞迁移能力下降。