可溶性淋巴细胞活化基因-3、α-突触核蛋白水平对帕金森病诊断效能的临床研究

钱小娟，蒋森，蔡倩，刘娜，张杨，杨新玲

帕金森病(PD)是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，是目前严重危害国民健康和生活质量的疾病之一[1]。PD主要的病理学特征为黑质中路易小体(LBs)的积累和携带LBs的多巴胺能神经元的凋亡，LBs是存活于神经元中的嗜酸性包涵体，富含多种蛋白，包括α-突触核蛋白(α-syn)、Parkin蛋白、泛素等，其中α-syn是其最重要的成分。尽管许多遗传和环境因素与PD的发展有关，但疾病的确切病因目前尚不清楚。越来越多的证据表明，神经免疫炎症及α-syn聚集体在神经元间传递可能共同参与了PD的进展[2]。淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)是一种α-syn特异性膜蛋白受体，可与细胞外病理性α-syn结合，参与α-syn的内吞和促进α-syn传递，且加速了病理性α-syn诱导的多巴胺能神经元损伤和神经毒性的形成。可溶性LAG-3(sLAG-3)是成熟LAG-3裂解的产物，被认为是辅助T细胞活性的重要指标，一定程度可反映CNS的炎症活动，在CSF和外周血中能稳定表达[2-3]。更多的研究专注于探索新的生物学标志物，如α-syn、多巴胺代谢物、促炎因子、miR-221等，然而临床上仍缺乏诊断价值较高且能有效地用于PD诊断和预测疾病进展的生物学标记物[4]。

本研究探讨了PD组与对照组中血清sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn表达水平的差异，分析了血清sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn与PD临床症状及疾病严重程度的相关性，研究了血清sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn对PD患者的诊断效能和血清sLAG-3与血浆和红细胞α-syn的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020年12月至2021年4月于新疆医科大学第二附属医院神经内科住院的47例PD患者作为PD组。纳入标准：(1)由神经内科医师诊断、符合英国PD脑库的原发性PD诊断标准；(2)患者能够提供详细真实的临床资料并完成相关量表的测评。排除标准：(1)帕金森综合征；(2)严重认知功能障碍不能配合检查患者及合并肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病及急慢性感染的患者。选取本院门诊同期年龄、性别与PD患者相匹配的36名健康体检者作为对照组。纳入标准：(1)无PD和PD家族史。(2)无其他神经系统退行性疾病史。排除标准：不能配合检查患者及合并肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病及急慢性感染患者。本研究所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 所有受试者均由专业神经内科医师采集其病史和人口学资料，包括年龄、性别、吸烟饮酒史、慢性病史、Hoehn-Yahr(H-Y)分级、统一PD评分量表(UPDRS)、PD非运动症状评价量表 (NMSS)及病程等。

1.2.2 sLAG3水平检测 清晨抽取所有受试者空腹肘静脉血4 ml，采用离心机以5 000 r/min的转速离心10 min，移取上清液至EP管，放-80 ℃冰箱保存。相关检测均严格遵循对应试剂盒的操作指南进行，每个样本做两个复孔,最终数据取均值。

1.2.3 血浆和红细胞α-syn水平检测 用含有抗凝剂的抽取所有受试者空腹肘静脉血4 ml，采用离心机以5 000 r/min的转速离心10 min，分离血浆和红细胞，分别置于EP管，放-80 ℃冰箱保存。采用ELISA检测血浆和红细胞α-syn水平。相关检测均严格遵循对应试剂盒的操作指南进行，每个样本做两个复孔,最终数据取均值。

2 结 果

2.1 两组一般临床资料及检测指标比较 见表1。

表1 一般临床资料的比较[x±s,例(%),M(Q25,Q75)]资料PD组(n=47)对照组(n=36)t/Z/χ2值P值年龄(岁)64.98±10.9762.25±9.461.1910.237男性20(42.6)19(52.8)0.8560.355糖尿病5(10.6)6(16.7)0.6440.442高血压14(29.8)11(30.6)0.0060.940吸烟9(19.1)6(16.7)0.8500.771饮酒5(10.6)7(19.4)1.2780.258sLAG3(ng/mL)0.94(0.78,1.04)0.72(0.55,0.85)-5.023<0.001 红细胞α-syn(ng/mL)61.15(59.67,61.06)48.61(42.06,55.34)-6.584<0.001血浆α-syn(ng/mL)30.20(26.92,33.41)22.66(19.70,26.57)-6.469<0.001

两组年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒史比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较，PD组血清sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平均明显增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平与PD临床特征的相关性分析 见表2。在PD组中，行Spearman相关分析显示，血清sLAG-3水平与性别(R=0.421,P=0.003)和NMSS(R=0.323,P=0.027)相关，而与病程、H-Y分级、UPDRS Ⅲ、NMSS总分不相关(均P>0.05)。红细胞α-syn和血浆α-syn水平与性别、病程、H-Y分期、UPDRS Ⅲ、NMSS总分均不相关(均P>0.05)。

表2 sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平与PD临床特征的相关性分析血清sLAG-3RP值血浆α-synRP值红细胞α-synRP值性别0.4210.003-0.0270.8570.0100.949病程-0.0020.988-0.2260.127-0.0200.895H-Y分期-0.0160.915-0.0320.829-0.0710.636UPDRSⅢ0.0270.858-0.1360.362-0.1950.189NMSS0.3230.027-0.2670.0700.0350.814

2.3 ROC曲线分析血清sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平对PD发病的诊断价值 见图1、表3。将血清sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平作为检验变量，将PD和对照分组作为状态变量制作ROC曲线，血清sLAG-3水平诊断PD的曲线下面积为0.822(95%CI：0.735～0.909)，敏感度61.7%、特异度86.1%。红细胞α-syn水平诊断PD的曲线下面积为0.923(95%CI：0.871～0.976)，敏感度83.0%、特异度83.3%。血浆α-syn水平诊断PD的曲线下面积为0.916(95%CI：0.860～0.972)，敏感度为97.7%、特异度为66.7%。

图1 sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平对PD诊断价值的ROC曲线

表3 ROC曲线分析血清sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平对PD发病的诊断价值变量ROC曲线下面积约登指数敏感度特异度sLAG-30.822(0.735～0.909)0.48361.7%86.1%红细胞α-syn0.923(0.871～0.976)0.66383.0%83.3%血浆α-syn0.916(0.860～0.972)0.66797.7%66.7%

2.4 不同浓度sLAG-3分组中sLAG3、红细胞α-syn、血浆α-syn表达水平的比较 见表4。根据sLAG-3水平ROC曲线取sLAG3最佳截断值0.885 ng/ml，将所有受试者重新分组：高sLAG-3组和低sLAG-3组，比较两组sLAG3、红细胞α-syn、血浆α-syn表达水平的差异。高sLAG-3组中sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn表达水平均明显高于低sLAG-3组水平，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表4 高sLAG-3组和低sLAG-3组sLAG-3、红细胞α-syn、血浆α-syn水平的比较[M(Q25,Q75),x±s]组别LAG-3红细胞α-syn血浆α-syn低sLAG-3组(n=49)0.71(0.59,0.80)53.40±10.2726.17±5.37高sLAG-3组(n=34)0.98(0.94,1.08)60.74±8.7528.58±4.40t/Z值7.716-3.397-2.161P值<0.0010.0010.034

2.5 血清sLAG-3与红细胞α-syn和血浆α-syn水平的二元Logistic回归分析 见表5。将所有受试对象的血浆α-syn、红细胞α-syn水平作为协变量，不同LAG-3浓度分组作为因变量，二元回归分析显示红细胞α-syn水平与sLAG-3相关(P<0.05，OR=1.073)。

表5 血清sLAG-3与红细胞α-syn和血浆α-syn水平的二元Logistic回归分析变量BSEWalsP值OR值95%CI下限上限血浆α-syn0.0410.0520.6310.4271.0420.9411.155红细胞α-syn0.0710.0286.2190.0131.0731.0151.134

3 讨 论

病理性α-syn的扩散是PD进展的关键过程，目前研究[5]发现，α-syn在细胞间的传递有以下几个途径，如LAG-3、外泌体、小胶质细胞、肠神经、纳米隧道管、经典的内吞和胞吐途径等。LAG-3作为细胞表面的受体，优先结合淀粉样蛋白中的α-syn，从而启动α-syn在细胞间的传递[6]。Zhang等[7]揭示了LAG-3 D1结构域通常以有碱性的表面来结合α-syn的酸性碳末端，特别是其残基118至140。病理性α-syn的形成不仅破坏α-syn的C端与形成淀粉样蛋白的核心分子相互作用，还可以将C端凝聚在原纤维表面上，显著提高α-syn与受体的结合亲和力，加速α-syn在细胞间的传递。已有动物模型[8]证实了LAG-3参与病理性α-syn跨细胞转移，并促进PD的发生发展。LAG-3成熟后裂解形成的sLAG-3可通过血-脑屏障到达外周血中，并在血液中稳定表达。

Guo等[9]采用MSD电化学发光(ECL)技术测定CSF和血清中的sLAG-3，结果显示，与对照组相比，PD患者CSF中的sLAG-3水平较低(P<0.001)，而两组间血清sLAG-3表达水平差异无统计学意义(P=0.16)。本研究及其他研究[10-12]结果提示PD患者的血清sLAG-3水平相对于对照组升高，上述结果不一致，差异部分可能为研究采用了不同的检测技术，相比ELISA检测技术，ECL技术具有更高的重复性、稳定性、灵敏度和同质性[13]。

Guo等[9]进一步对3个LAG-3单核酸基因多态性进行了基因分型，其中rs1922452-AA和rs951818-CC基因型被证实会增加中国女性PD的发病风险。目前sLAG-3性别表达差异的原因有可能与基因变异、炎症反应及雌激素水平等有关。雌激素会影响神经免疫功能并上调MHC Ⅰ和Ⅱ的表达，LAG-3作为免疫调节剂与MHC-Ⅱ分子有很高的亲和力，雌激素可通过MHC-Ⅱ受体抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，调节CNS的神经炎症过程，对神经细胞有保护作用[14]。本研究中，女性sLAG-3水平0.90(0.69,1.02)高于男性sLAG-3水平0.79(0.70,0.89)，但差异无统计学意义(P=0.119)。该结果与已报道的结果不一致，主要是本研究纳入的女性PD患者并非全是绝经后女性，卵巢功能尚存，体内的雌激素对炎症反应抑制较弱，神经细胞仍受雌激素保护；样本量较少，有实验误差，进一步做单因素相关分析时发现，sLAG-3表达水平与性别相关(R=0.421,P=0.003)。目前对sLAG-3水平与疾病的严重程度、认知、NMSS及病程的相关性研究结果不一致。郭丹丹[12]研究结果显示，sLAG-3水平与H-Y有关，与UPDRS各部分评分、病程、NMSS不相关。Cui等[11]的一项多中心研究发现，sLAG-3水平与疾病运动症状的严重程度不相关，与NMSS量表有相关性，尤其与非运动症状中的日间过度嗜睡有关。在本研究发现，sLAG-3水平与H-Y分期、UPDRSⅢ、病程均不相关(P>0.05)，与NMSS量表相关(R=0.323,P=0.027)。综上所述，sLAG-3水平与PD病情严重程度的关系尚不明确，本研究纳入的PD患者多为服药后的患者，抗PD药物可能会削弱了sLAG-3与运动症状严重程度的相关性，因此，未来需要纳入更多初发病的PD患者做进一步研究。以往对非运动症状的研究[11,15]显示，炎症因素的增加与认知功能下降、睡眠行为障碍、疲劳和抑郁等有关，由于sLAG-3是与细胞因子分泌相关的细胞免疫指标，一定程度上可以反映PD非运动症状的严重程度。

α-syn主要是细胞内聚集蛋白。既往研究[16]发现，PD患者CSF中有α-syn寡聚体。α-syn寡聚体可透过血-脑屏障进入外周血中，而血液中几乎所有(99%)的α-syn都包含在红细胞中，血浆仅含0.1%、外周血单核细胞包含0.05%、血小板包含0.2%。血浆α-syn研究结果非常不一致，可能与不同程度的溶血有关[17]。由于红细胞是在制备过程中有分离和洗涤，因此溶血过程中被破坏的细胞膜或细胞内含物的污染不太可能会影响到红细胞α-syn水平。Foulds等[18]对血浆中α-syn表达水平研究发现，与对照组相比磷酸化α-syn表达水平明显高于对照组，而总的α-syn和寡聚体α-syn水平两组间差异无统计学意义。Tian等[16]对红细胞中的总α-syn、寡聚体α-syn和磷酸化α-syn(pS129)研究发现，与对照组相比PD组总α-syn和磷酸化α-syn明显高于对照组，而两组间寡聚体α-syn差异无统计学意义。本研究发现，PD患者血浆及红细胞中的α-syn明显高于对照组，两组红细胞中的α-syn水平明显高于血浆的α-syn水平，这与一些研究[4,19]结果一致。

目前对红细胞和血浆中α-syn与PD病程、临床症状严重程度研究结果尚不一致。Wang等[4]研究结果显示，红细胞α-syn水平与临床特征无明显的相关性，而血浆α-syn与病程、MoCA评分、H-Y分期、UPDRS存在明显的正相关。Chahine等[20]发现血浆α-syn与疾病的严重程度相关。本研究发现红细胞和血浆α-syn水平与病程、H-Y分期、UPDRS、NMSS均不相关，这与研究[17,19]得出的结果一致。可能的原因为α-syn寡聚体对PD的更多作用于多巴胺神经元凋亡的促发阶段，包括改变细胞骨架、增加膜通透性、促进Ca2+内流等，而非多巴胺神经凋亡的结果，因此推测，PD患者外周血α-syn水平检测疾病进展的价值较低。

本研究比较了sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn表达水平对PD的诊断效能，ROC曲线显示，检测血清sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn表达水平对诊断PD都有一定的诊断价值。根据sLAG-3最佳截断值将所有受试者分组后显示，高sLAG-3组中的红细胞和血浆α-syn水平均高于低sLAG-3组。进一步对红细胞和血浆α-syn水平做回归分析发现，红细胞α-syn与sLAG-3相关。α-syn寡聚体透过血-脑屏障进入外周血，大部分聚集于红细胞内，而LAG-3作为细胞表面受体可特异性地结合α-syn寡聚体。由此推测，LAG-3可能参与了α-syn寡聚体聚集于红细胞的过程，有促使红细胞内α-syn寡聚体形成的作用。

综上所述，血清 sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn在PD组中有高表达；PD组中血清sLAG-3水平与性别、NMSS相关；血清sLAG-3与红细胞α-syn水平有相关性，检测血清sLAG-3、红细胞α-syn和血浆α-syn水平对PD都有一定的诊断价值。