Wnt/β-catenin信号通路与帕金森病的研究进展

孙 雪， 李金田， 金 华综述， 梁建庆，2审校

帕金森病(Parkinson’s disease，PD) 是神经系统退行性疾病，临床以静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等运动障碍为主要表现。患者发病年龄多大于60岁，≥65岁老年人患病率约为 1.7%[1，2]。研究表明中脑黑质致密区多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewis Body，LB)形成是诱导PD发生的重要病机[3]，最终导致胆碱能系统功能相对亢进，造成PD患者出现运动功能障碍及认知和心理等其他非运动症状。PD发病机制迄今尚未完全阐明。

Wnt是参与动物发育的重要信号分子，在器官发育、细胞增殖、分化凋亡、神经发生和干细胞维持等方面都发挥了重要的调节作用[4～6]。Wnt信号通路中以经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路(canonical Wnt/β-catenin)作用最为广泛，其与多种神经系统疾病的发生和发展有关[7]。Wnt/β-catenin 信号通路的异常与PD的发生密切相关[8]，现对 Wnt/β-catenin 信号通路与PD发病、相关分子表达等研究进展进行综述。

1 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt/β-catenin信号通路是一条在进化中高度保守的信号通路。Wnt信号依据转导方式的不同分为3种通路：经典的Wnt(canonical Wnt /β-catenin)信号通路、Wnt-PCP(Wnt-planar cell polarity)信号通路、Wnt-Ca2+信号通路，其分别负责激活细胞核内的特定基因、调控细胞骨架的重排、刺激细胞内钙离子的释放。研究发现，经典Wnt/β-catenin信号通路在调控中枢神经系统(central nervous system，CNS)方面发挥重要作用，与神经退行性疾病PD相关联[9，10]。Wnt/β-catenin通路主要通过细胞外因子wnt家族分泌蛋白、特异性跨膜受体卷曲蛋白(Frizzlled，Fzd)、散乱蛋白(scaffolding protein dishevelled，Dvl 或Dsh)、β-连环蛋白(β-catenin)、结肠腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatouspolyposiscoli，APC)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、轴蛋白或传导蛋白(Axin或Conductin)及T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer-binding factor，LEF)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related protein5/6，LRP-5/6)等激活靶基因表达。经典Wnt/β-catenin 信号通路的激活以β-catenin为核心，启动因子是Wnt蛋白。

当Wnt蛋白缺失时，Wnt/β-catenin途径无法被激活。胞内的GSK-3β、APC蛋白、Axin及CK1组成破坏复合物，介导β-catenin的磷酸化。随后磷酸化的β-catenin被泛素介导的蛋白酶体识别并降解，细胞内的β-catenin处于低水平无法转移到细胞核中，下游基因的表达被抑制，Wnt/β-catenin途径中断[11]。

当Wnt蛋白存在时，Wnt/β-catenin途径被激活。Wnt与其主要受体Frizzled及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合，激活胞内的Dsh蛋白，释放GSK-3β，导致 APC/Axin/GSK-3β/CK1复合体解离，β-catenin 的磷酸化被抑制而免于降解[12]。随后稳定积累的β-catenin进入细胞核中，与转录因子TCF/ LEF结合募集一系列共激活因子，激活下游靶基因的转录，诱导染色质结构变化，促进细胞的增殖与分化。Wnt信号通路的激活和失活过程见图1[13]。

图1 Wnt信号通路图(引自Wisniewska MB，2013)

2 Wnt/β-catenin信号通路与PD

Wnt/β-catenin 信号通路具有调节细胞分化及增殖等功能，能够促进DA能神经元新生、细胞存活以及突触发生，是促进神经再生修复的重要信号通路之一。不同的PD模型中均发现Wnt信号的受损或者被抑制。L’Episcopo[14]等运用神经干/祖细胞(mNPCs)体外培养以及对基因小鼠MPTP(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyri-dine)模型的体内研究，证实衰老抑制了Wnt信号转导，而β-catenin的特异性GSK-3β拮抗剂在原位激活促进了与运动功能障碍逆转相关的DA能神经修复。L’Episcopo等[15]还利用MPTP诱导的PD动物模型发现，黑质纹状体中DA能神经元功能的丧失与恢复和Wnt/β-catenin通路的激活相关。Singh[16]等证实Axin-2 / Wnt /β-catenin信号传导在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PD大鼠模型中改善了其行为学功能并通过增加PD大鼠的线粒体功能来保护黑质DA能神经元。Mishra等[17]研究结果表明，DA受体通过激活PD大鼠模型中的Wnt /β-catenin信号传导来调节DA能神经发生和线粒体功能。MPTP诱导的PD模型中，神经元凋亡与低水平的β-catenin以及高活性的GSK3β相关，通过药物提高β-catenin 蛋白水平激活 Wnt/β-catenin 信号通路对PD模型具有神经保护作用[18]。

相关实验还发现，姜黄素可激活Wnt/β-catenin信号通路，增强Wnt3a、β-catenin蛋白表达，发挥神经保护作用[19，20]。肉苁蓉能改善6-OHDA颅内注射建立的PD大鼠的行为障碍，通过抑制GSK-3β、p-β-catenin蛋白的活性，增加β-catenin蛋白表达，激活Wnt信号通路，从而保护DA神经元[21]。红景天通过Wnt/β-catenin信号通路，保护神经元免受缺血性损伤[22]，以及调节骨髓充质干细胞向神经细胞的定向分化[23]。滕龙等[24]实验表明复方地黄颗粒(由熟地黄、珍珠母、炒丹参等组成)能通过调控GSK3β信号通路，影响细胞凋亡，达到改善PD症状。

上述研究结果都表明Wnt/β-catenin信号途径与DA能神经元存活、突触发生密切相关，在PD的发生发展中发挥重要作用。

3 Wnt/β-catenin信号通路在PD中相关分子的表达

Wnt/β-catenin信号通路作为一条多环节、多作用靶点、复杂的蛋白质作用网络，参与了神经发生的生理过程，而异常的Wnt信号通路参与PD发生发展的病理过程。进一步了解Wnt信号通路配体、受体和共受体间的多种潜在作用方式，确定其内部组分的功能对于PD的治疗靶点至关重要。Wnt/β-catenin信号通路相关分子庞大，种类丰富，其基本特性也各有千秋。近年来的研究发现Wnt1、LRP6、β-catenin、GSK3β、Fzd与PD 的关系密切。现针对上述重要信号分子在PD中发挥的作用进行一一阐述。

3.1 Wnt1 Wnt蛋白由350～400个氨基酸组成，其羧基末端含有23或24个保守的半胱氨酸残基Wnt1属于细胞外因子Wnt家族分泌蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路中的配体蛋白。同时，Wnt1也是Wnt/β-catenin信号通路的启动蛋白，可与受体结合激活通路。Wurst等[25]研究表明Wnt1是调节中脑DA前体细胞增殖分化的重要分子，Wnt1缺失会使中脑发育紊乱。Andersson等[26]研究表明Wnt1协调DA规范和体内神经发生，通过基因相互作用与Wnt5a共同促进体内中脑DA神经元的发育。Wnt1是DA能神经元发育的关键调控因子[27]。Wnt1涉及的神经保护作用主要分为两个方面。一方面是直接作用：Wnt1由星形胶质细胞分泌，与卷曲受体Fz结合，并对DA能神经元产生直接的保护作用[28]。另一方面是间接作用：Wnt1也可能通过自分泌作用与星形胶质细胞上的受体结合，并调节星形胶质细胞对DA能神经元的保护作用。Wnt1是富含半胱氨酸的糖基化蛋白，可促进神经元细胞和星形胶质细胞的串扰，从而在PD模型中发挥神经保护作用[29]。谷氨酸的兴奋性毒性被认为是PD的发病机理[30]，星形细胞是大脑中Wnt信号的重要来源。研究证实，Wnt1能促进兴奋性氨基酸转运蛋白EAAT2(可清除过量谷氨酸)在星形细胞中的表达，并介导星形胶质细胞对DA能细胞的保护作用[31]。目前研究表明，Wnt1在PD中有着不可或缺的调控作用，Wnt1的存在确保中脑有适当的神经发生，DA代谢功能的获得以及神经元的存活[32]。

综上，Wnt1在Wnt/β-catenin信号通路中作为启动因子，通过直接或间接方式保护DA能神经元，以达到改善PD症状的目的。

3.2 LRP6 低密度脂蛋白受体(LDLR)相关蛋白6(LRP6)是一个单一的跨膜蛋白，与LRP5用于引导Wnt /β-catenin的正常激活及反应，在PD的病理过程中发挥重要作用。LRP6在Wnt /β-catenin信号通路中被磷酸化，磷酸化的LRP6与GSK3β结合直接抑制β-catenin磷酸化，确保β-catenin稳定易位至核以调节Wnt靶基因表达的稳定[33，34]。LRP6是腹中脑(VM)和正常VM形态发生中DA分化所必需的，在DA神经元发育的早期阶段的分化中具有作用[35]。Branco等[35]通过LRP6突变小鼠实验，在胚胎第(E)11.5 d观察到了TH阳性神经元数量的明显减少，中脑形态发生的缺陷，DA前体分化的发作有所延迟。LRP6介导的Wnt /β-catenin信号通路对神经元突触完整性和神经元活性具有至关重要的作用[36]。

目前，对于LRP6通过Wnt /β-catenin信号通路与PD相关性的报道较少，但就已报道研究可见LRP6在Wnt /β-catenin信号通路中必不可少的作用以及对中脑发育的影响，我们有理由认为其与PD密切相关。

3.3 β-catenin β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt /β-catenin信号通路的主要成分，起着细胞黏附的作用，在大脑的发育、功能维持和病理情况下都有着重要的作用。Zhao等[37]在细胞水平证实β-catenin是调控DA能神经发生的关键分子，它通过维持神经微环境的完整性和神经前体细胞向DA能神经元的发育进程来调控DA能神经元的发生。基因和胚胎的研究发现，β-catenin是通过从细胞质转入细胞核中进行信号传导[38]。经典Wnt途径被激活后，β-catenin得以进入细胞核积累，与转录因子结合使基因表达。β-catenin增高并发生的核转位可以促进细胞内基因的激活，这种激活有促进凋亡和抑制凋亡两方面的作用[39，40]。孙欣等[41]采用MPTP亚急性方法处构建PD小鼠模型，研究发现，PD模型中β-catenin在腹侧中脑的表达增加了，且β-catenin发生了核转移，证实β-catenin与神经退行性变的过程有关联。Zhao等[42]通过研究表明，β-catenin的缺乏导致黑质DA能神经元基础水平的氧化应激升高，并进一步加强了百草枯(PQ)诱导的黑质和纹状体轴突终末TH+神经元的氧化损伤和丢失，表现为加剧了PD运动障碍。β-catenin的稳定恢复了黑质纹状体的可塑性和运动协调性，而DA神经元中β-catenin的消融改变了运动障碍，并影响纹状体mRNA水平，影响了一些已知调节突触可塑性和DA神经传递的标志物[43，14]。

综上，β-catenin作为Wnt /β-catenin信号通路的主要成分，通过调控DA能神经元的发生达到改善PD运动障碍的目的。

3.4 GSK3β 糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是一种多功能的丝氨酸/酪氨酸，其活化与神经元凋亡的增加直接相关，在PD的相关研究中认为其可以作为治疗靶点。Nagao等[44]运用免疫组织化学方法检测了GSK-3β在PD患者脑组织中的表达，证实GSK-3β与LB中a-突触核蛋白(a-synuclein)的表达密切相关。在Wnt /β-catenin信号通路中，GSK3β蛋白的表达被抑制或减弱，则无法形成破坏复合物，从而无法介导β-catenin磷酸化，游离的β-catenin转移进核内与结合蛋白一起触发下游靶基因的转录，促进细胞的增殖与分化。体内病理性a-synuclein聚集及自噬功能失衡将引起DA能神经元的退行性病变，出现PD。李芳毅等[45]研究发现GSK-3β可上调自噬水平，间接影响细胞对a-synuclein的降解能力，从而起到保护神经细胞的作用。GSK-3β失调有利于PD病理发生过程中特定区域的磷酸化及Tau和a-synuclein(PD发生中最重要的两基因)的积累[46]。研究表明，GSK-3β的抑制减少了由MPTP毒性诱导DA能神经元损伤[47，48]，暗示GSK-3β与PD发病机制有关。Chen等[49]实验表明GSK-3β是与神经退行性疾病相关的促凋亡信号级联反应中的关键中间体，介导6-OHDA诱导的神经元死亡。GSK-3β通过调节多种信号通路来影响PD发病机制中涉及DA能神经元变性等病理事件，包括线粒体功能障碍，氧化应激，蛋白质聚集和炎症反应[50～54]，最终确保DA能神经元的存活，阻断与PD发病机理有关的致病途径。

综上，众多研究表明，GSK-3β的表达被抑制可以保护DA能神经元免受各种应激诱导的损伤，证实GSK-3β与PD发病机制的关联性。

3.5 Fzd Wnt受体特异性跨膜受体卷曲蛋白(Frizzlled，Fzd)为7次跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体，Fzd胞外N端具有富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，该结构域由120至125个残基组成，具有10个保守的半胱氨酸，是Wnt分子结合所必需的[55]。研究证实，成熟的中脑表达DAT的神经元包含大多数Fzds，其中经典的Wnt受体Fzd-1最丰富[28]。Fzd-1受体是中脑DA神经元的下游促存活效应子，与Wnt1共同参与星形胶质细胞神经保护作用。

目前，Fzd蛋白家族在Wnt /β-catenin信号通路中针对PD发挥的作用研究不够透彻，相关报道较少，但其作为配体是激活通路中必不可少的蛋白。

4 研究Wnt /β-catenin信号通路在PD治疗中的意义

4.1 PD目前治疗的局限性 现今，口服补充患者脑中DA的药物是PD的首选治疗方法，但药物长期使用会导致疗效降低，运动障碍等后期并发症，严重影响患者生活质量。此外，手术治疗、中医治疗、照料护理也在PD的治疗中有一定的作用。但这些治疗措施只能暂时缓解患者的症状，并不能阻止DA能神经元的进行性丢失，最终仍是无法控制PD的发展。临床PD的针对性治疗还有待突破。

4.2 探索Wnt /β-catenin信号通路的意义 PD的发病机制尚不清楚，黑质纹状体的DA能神经元发生退行性变是导致其发生的主要病理特征。尚认为此系统存在一定的可塑性，因其黑质的DA能神经元减少是发生在临床症状出现之前，若能对DA能神经元进行调控，可改善临床症状。近年来，经过科研人员的深入研究，发现Wnt/β-catenin 信号通路具有调节细胞分化及增殖等功能，能够促进DA能神经元新生、细胞存活以及突触发生，是促进神经再生修复的重要信号通路之一[56]。课题组前期研究发现，复方地黄颗粒可能通过调控PD大鼠脑组织右侧纹状体Wnt/β-catenin信号通路起到保护DA能神经元的作用[57]。这一发现有望成为PD治疗瓶颈的新突破。进一步探索Wnt信号通路配体、受体、共受体等之间的多种作用方式，以及Wnt信号通路激活或抑制状态下各种指标的动态演变，对于PD发病机制研究至关重要，同时也可阐明药物治疗PD的作用靶点，为再生以及转化医学的发展提供新的思路和线索。