抗坏血酸对铜胁迫蚕豆种子萌发和根尖细胞损伤的缓解作用

秦永燕，王雪婷，班子茹，宋晓丹

（长治学院生命科学系，山西长治 046011）

重金属污染环境是当今环境学、生物科学交叉领域备受关注的焦点。铜作为植物生长必需的微量元素，可以激活多酚氧化酶、细胞色素氧化酶及抗坏血酸氧化酶等多种酶类参与植物体内的生理代谢。研究表明低浓度的铜可促进植物生长，高浓度会抑制植物生长，产生毒害作用。近年来，随着工业、农业、养殖业和采矿业等的开发，含铜物质的大量排放，致使土壤中铜离子的浓度逐日增加，造成环境污染。

目前，土壤修复技术主要包括物理修复、化学修复和生物修复等，其中生物修复周期长，见效慢；物理修复和化学修复见效快，但容易造成二次污染。抗坏血酸（Ascorbic Acid，AsA）即维生素C，不仅是植物重要的非酶抗氧化剂，还是一种绿色环保的还原剂，它可以降低外界环境对植物造成的伤害如病害、紫外线辐射、干旱等。研究表明，少量的抗坏血酸能够使植物增强胁迫环境下的抵抗能力；能够有效地缓解高浓度的铅或汞对植物的毒害，而且，在一定程度上减轻铜胁迫对广藿香幼苗生长的毒害作用。

目前对水环境污染的监测方法有物理、化学和生物等手段，其中生物手段可以直接评估出水环境污染的生物学效应，并且对污染物的污染程度有直接的指示作用。蚕豆（）根尖细胞微核技术应用于水质污染监测具有良好的指示作用。该技术已经被世卫组织、联合国环境署、美国国家环保局等多个机构确定为水环境污染的评估标准。1986 年，我国也将蚕豆根尖微核技术列入水环境测试的技术规范。研究表明蚕豆根尖微核率与重金属、生物碱等的毒性具有较好的相关性。抗坏血酸作为植物体内一种重要的小分子非酶抗氧化物。近年来，利用外源AsA 提高植物抵御外界胁迫方面有了一定的研究和应用，如减轻Al胁迫对水稻幼苗的氧化损伤，缓解蚕豆根尖细胞由于Pb、Hg胁迫而引起的遗传毒性效应。因此，本试验以蚕豆为试验材料，比较铜单独处理和铜与抗坏血酸联合处理后蚕豆种子萌发，胚根长、胚芽长、根系活力、以及蚕豆根尖有丝分裂指数、染色体畸变率和微核千分率，研究抗坏血酸对铜胁迫蚕豆种子萌发和根尖细胞遗传毒性效应的影响，旨在为缓解重金属铜污染提供一种可靠的理论依据和可行的实验方案。

1 材料与方法

1.1 材料

蚕豆（），品种为北斗七星，来源于山东省临沂市（2020 年8 月收获的种子）。

1.2 方法

挑选没有病害的蚕豆种子，先用蒸馏水漂洗2次，再用2%HO浸泡消毒10 min，蒸馏水中浸泡24 h 备用。

1.2.1 蚕豆种子萌发

选择同一批购买的饱满一致的蚕豆种子放入铺有湿润滤纸的培养皿中，于（23±1）℃条件下萌发。处理一（T1）：分别加入不同浓度的硫酸铜溶液10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 进行处理，记作T1-1，T1-2，T1-3，T1-4，T1-5，以蒸馏水培养为对照组（记作T1-CK）。处理二（T2）：以加入20 mg/L 抗坏血酸溶液培养为对照组（T2-CK），其余处理分别为10 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、20 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、40 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、60 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、80 mg/L CuSO+20 mg/L AsA混合溶液处理，分别记作T2-1，T2-2，T2-3，T2-4，T2-5。抗坏血酸的浓度参照李贺勤等的研究结果以及前期预试验结果综合选择。培养期间每天补充相应浓度的处理液。各浓度处理每皿10 粒种子，每次10皿，重复3 次。从对照组种子萌发（胚芽的长度大于等于种子长度的1/2 且胚根与种子长度相等视为萌发）开始，每天上午9 点记录各处理种子的发芽数，连续统计7 d。整个发芽试验参照国际种子检验协会制定的种子检验规程（1996），用游标卡尺测量胚根长和胚芽长，用TTC 法测定其根系活力。

发芽势（%）=正常发芽种子数/供试种子数×100

发芽率（%）=正常发芽种子数/供试种子数×100

发芽指数（）=∑/，式中，为时间的发芽数，Dt 为相应的发芽天数。

活力指数（）=×，式中，为幼苗高度。

1.2.2 蚕豆根尖细胞学观察

按照1.2.1 中方法处理20 h 后，用蒸馏水恢复培养24 h，剪取根尖，于Carnoy 固定液中固定12～24 h，置于70%乙醇冰箱保存，备用。

常规压片镜检，每个处理观察1000 个分生区细胞，设5 个重复，统计其微核率、有丝分裂指数和染色体畸变率。其中，有丝分裂指数MI（%）及微核千分率MCN（‰）的计算方法如下：

MI（%）=（样品有丝分裂发生细胞数/样品观察到的细胞数）×100；

MCN（‰）=（样品MCN 发生细胞数/样品观察到的细胞数）×1000；

染色体畸变率（%）=（畸变细胞数/分裂期细胞总数）×100。

1.3 数据统计与分析

数据处理均采用SPSS 25.0 进行分析，并用检验进行组间差异检验，以＜0.05 为差异具有统计学意义。实验结果均用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 铜对蚕豆种子萌发的影响

由图1 可知，T1 和T2 组实验结果表明，随着铜离子处理浓度的增加，蚕豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数逐渐下降，且均低于对照。当铜离子浓度低于20 mg/L 时，与各对照相比差异不显著（＞0.05），当铜离子浓度高于40 mg/L 时，与各对照相比差异显著（＜0.01），表现出一定的抑制作用。

图1 铜与抗坏血酸对蚕豆萌发的影响

T2 组与T1 组实验结果相比，在相同铜离子处理浓度下，联合处理后，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均有不同程度的增加。当铜离子浓度为40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 时，蚕豆种子的发芽率分别增加了3.80%、4.62%、5.05%；发芽势分别增加了2.95%、6.70%、6.75%；发芽指数分别增加了4.44%，9.11%，14.10%；活力指数分别增加了21.54%、28.72%、52.96%。以上结果表明联合处理有一定的促进作用，且浓度越高，促进作用越大。

2.2 铜对蚕豆幼苗早期生长的影响

由图2 可知，T1 和T2 组实验结果表明，随铜离子处理浓度的增加，蚕豆胚根长、胚芽长和根系活力均呈先增加后下降趋势。当铜离子浓度为40 mg/L、60 mg/L 和80 mg/L 时，T1 组中根系活力的抑制率分别为28.23%、43.53%和62.35%；胚根长的抑制率分别为0.39%、31.98%和46.90%；胚芽长的抑制率分别33.48%，37.10%和51.58%；T2 组中根系活力的抑制率分别为2.15%，16.13%和38.71%；胚根长的抑制率分别为0.14%、26.64%和43.41%，胚芽长的抑制率分别为25.10%、29.67%和40.46%；均低于T1 组的抑制率，表明联合处理对铜抑制蚕豆早期生长有一定的缓解作用。

图2 铜与抗坏血酸对蚕豆生长的影响

T2 与T1 组相比，当铜离子浓度为40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 时，蚕豆根尖根系活力分别增加49.18%、62.5%和78.13%；胚根长分别增加了35.60%，45.86%，44.16%；染色体胚芽长分别增加了22.79%，21.94%，34.11%。因此，联合处理可以缓解铜对蚕豆根尖的损伤作用，且铜离子浓度越高，联合处理的促进作用越强。

2.3 蚕豆根尖微核率、有丝分裂指数和染色体畸变率的变化

由图3 可知，T1 组中，随着铜离子处理浓度的增加，蚕豆根尖有丝分裂指数（M）I 呈先上升后下降的趋势。当铜离子浓度为20 mg/L 和40 mg/L时，有丝分裂指数最高，分别为8.51%和7.34%，与对照相比，分别提高了49.36%和28.81%，差异显著（＜0.05），说明低浓度可促进细胞分裂。其余处理组有丝分裂指数与对照差异不显著（＞0.05）。随着处理浓度的增加，微核率和染色体畸变率逐渐增加，当铜离子浓度为80 mg/L 时，微核率最高，为19.56‰，是对照组的3.15 倍；染色体畸变率最高，为4.77%，是对照组的1.73 倍。表明高浓度的铜离子对蚕豆根尖有一定的损伤作用。

图3 蚕豆根尖细胞微核率及染色体畸变率的变化

T2 组中随着处理浓度的增加有丝分裂指数呈先上升后下降趋势，各处理组均高于对照组，且差异显著（＜0.05）。当铜离子浓度为20 mg/L 时，有丝分裂指数最高为9.05%，高于对照59.61%；蚕豆根尖微核率和染色体畸变率随处理浓度的增大而增加。当铜离子浓度为80 mg/L 时，微核率最高，为17.79‰，是对照组的2.86 倍；当铜离子浓度为80 mg/L 时，染色体畸变率最高，为4.45%，是对照（2.75%）的1.62 倍。

T2 与T1 组相比，当铜离子浓度为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L 和80 mg/L 时，蚕豆根尖有丝分裂指数分别提高了4.14%，6.35%，14.58%、19.77%和20.21%；T2 组微核率和染色体畸变率与均比T1 组低，随着处理浓度的增加，微核率分别下降了6.72%，7.09%，14.87%，14.75%，9.05%；染色体畸变率分别下降了2.08%，3.46%，5.42%，5.21%，6.71%。因此，联合处理可以缓解铜对蚕豆根尖的损伤作用。除微核率外，铜离子浓度越高，联合处理的促进作用越明显。

3 讨论与结论

利用蚕豆根尖微核实验研究不同浓度铜离子对蚕豆根尖的损伤效应。结果表明，当铜离子浓度为10 mg/L 时，蚕豆发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数，根长、根系活力、根尖有丝分裂指数、微核率和染色体畸变率都与对照差异不显著。当铜离子浓度为20 mg/L 时，蚕豆根长、株高、根系活力、有丝分裂指数显著高于对照，说明该浓度下铜可以显著促进蚕豆生长。此时，微核率低于10‰，根据微核率与污染程度的判定标准，认为该浓度基本无污染。当铜离子浓度为80 mg/L 时，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚根长、根系活力、均显著低于对照，微核率和染色体畸变率显著高于对照，对蚕豆根尖生长造成损伤。这与重金属可抑制根的伸长，出现植株矮小等状况相一致。这可能是因为过量铜富集在根部，抑制酶活性，损伤根部组织，影响植物生长。也可能是高浓度下铜进入植株体内后，与核酸、蛋白质和酶等大分子物质结合，或者取代某些酶和蛋白质行使其功能时所必需的特定元素，使其变性或活性降低，造成生理功能紊乱，抑制根尖细胞有丝分裂，增加微核率和染色体畸变率，此时，微核率为19.56‰，属于中度污染。苟本富研究表明随着Cu 浓度增大，蚕豆幼苗根尖中基因组DNA 损伤也越来越严重，本文与之研究结果相一致。

铜作为植物生长必需的微量元素，既会产生有益于对植物生长有利的亚铁氧化酶等，同时也会使植物体内的强氧化剂活性氧升高。因此，当铜离子浓度低时，对植物体产生的益处要大于活性氧产生的危害，表现出促进作用；当铜离子浓度高时，可导致植物体内产生大量的活性氧（ROS），使得DNA、蛋白质、膜脂及细胞其它组分严重受损，故染色体畸变率和微核率明显上升。此外，仲昭朝等研究表明活性氧可能介导铜胁迫造成根尖生长抑制，是植物在遭受重金属铜胁迫时细胞凋亡和线粒体膜损伤的重要生理信号。因此，高浓度的铜对蚕豆根尖生长会造成一定的毒害。

近年来，抗坏血酸作为植物体内一种重要的抗氧化剂，在植物抵抗各种胁迫过程中起着非常重要的保护功能。本文研究表明20 mg/L 抗坏血酸与铜联合处理与铜单独处理相比，胚根长、胚芽长、根系活力、有丝分裂指数均升高了，微核率和染色体畸变率均下降了。当铜离子浓度为80 mg/L 时，联合处理后（T2），有丝分裂指数显著高于对照，微核率下降，低于18‰，将中度污染降为轻度污染，说明20 mg/L 抗坏血酸可修复铜对蚕豆根尖的损伤。其原因可能是AsA 在植物细胞分裂与生长、细胞壁组成和光合作用等生长发育代谢活动以及抵御逆境胁迫的抗氧化保护等方面具有重要的调控功能有关；也可能是抗坏血酸发挥类似于休眠的作用来抑制细胞的有丝分裂从而使得活性氧水平下降而达到修复的作用。

综上所述，在实验浓度范围内，当铜离子浓度为0～20 mg/L 时，对蚕豆生长有促进作用，当铜离子浓度高于40 mg/L 时，铜对蚕豆根尖有不同程度的毒害损伤。联合处理后，20 mg/L 抗坏血酸可不同程度地缓解铜对蚕豆根尖细胞的毒害作用，而且铜离子浓度越高，缓解毒害作用越明显，具体缓解的机理仍需进一步探究。