广西荔浦槟榔芋软腐病病原鉴定

陈潇航，黄伟华，颜梅新

（1广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西南宁 530007；2广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东广州 510642；3广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所，广西南宁 530003；4百色市农业科学研究所／广西农业科学院百色分院，广西百色 533000）

芋〔（L）.Schott〕又名芋头，属天南星科，多年生草本植物。芋具有较高营养价值和药用价值，是世界各地广为栽培的特色蔬菜和粮食作物。广西是全国芋头主要产区之一，其中有着悠久栽培历史的荔浦芋，以其品质优及地域特色备受人们的喜爱，成为国家地理标志保护农产品。近几年，由于特色作物的发展和人们对芋头产品的青睐，芋头种植面积大幅度提高。种植方式从零星种植转变为连片规模种植，从而导致芋病虫害严重发生。自2015 年，广西荔浦多个槟榔芋种植田块相继出现一种细菌性病害。该病主要危害地下球茎，球茎染病，球茎组织变褐，向内腐烂，球茎迅速软化、腐败，出现黏液并散发恶臭味，最终全株枯萎倒伏死亡，具“细菌性软腐病”的明显特征，严重影响芋头产量和品质。据我们调查该病一般发病率为30%～50%，严重的全田失收。另外，由于该病的危害使得芋作物不能连栽，从而导致土地不能充分利用，种植成本提高，影响产量及市场供需，目前该病已成为阻碍芋头生产的重要制约因素，严重影响芋产业的发展。由于病因不明，病害防治困难，种植户强烈要求相关部门对该病害进行研究与控制。为明确广西荔浦槟榔芋“细菌性软腐病”的病原，本研究对该病原菌进行了分离，并利用生理生化测定和分子生物学手段对该病原菌进行鉴定，为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离和培养

从广西荔浦槟榔芋栽培区采集患芋软腐病的发病植株样本，选取具有典型软腐病症状的芋球茎发病组织，采用常规组织分离方法，将病组织依次按如下步骤进行表面消毒：95%乙醇浸泡15 s，75%乙醇浸泡30 s，无菌水清洗3 次。镜检后，将观察有喷菌现象的病组织浸出液，用无菌接种环接种于LB 培养基上，通过平板三区划线法进行菌株分离。平板置于28℃培养48 h，分别挑取单个菌落进行纯培养，保存于-80℃冰箱备用。

1.2 致病性测定

将槟榔芋球茎用水清洗干净，用干净的水果刀将芋球茎切成长4～7 cm，宽3～6 cm，厚度1cm 左右的切片，放置于直径15 cm 的培养皿中。将过夜培养的分离物配成10CFU·mL悬浮液，吸取5～10 μL 细菌悬浮液，滴至芋切片表面，芋切片周围放置湿水棉团，盖上皿盖保湿，置于28℃培养16～24 h，记录发病结果，设接种培养液为对照。对接种发病的芋球茎组织进行病原再分离，观察分离物是否与接种菌株一致。

1.3 细菌的形态和鞭毛观察

用无菌水将细菌配制成悬浮液，醋酸铀（pH4.5）负染1～2 s 后，电镜（JEM1200EX）观察并拍照。

1.4 生理生化测定

对能够导致芋球茎产生软腐病的分离物进行生理生化特性的测定，主要包括：革兰氏染色、接触酶、氧化酶活性、厌氧生长、D-葡萄糖发酵、乳糖发酵、麦芽糖发酵、山梨醇发酵、木糖发酵、棉子糖发酵、淀粉水解、明胶液化、37℃生长、甘露醇发酵、蔗糖发酵、D-海藻糖发酵、L-鼠李糖发酵、纤维二糖发酵等，试验重复3 次。

1.5 PCR 扩增

将细菌分离物在LB 培养基上培养24 h 后，采用细菌DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取细菌分离物全基因组DNA。以提取后的DNA 作为PCR 扩增模板，应用表1 所示引物进行PCR 扩增。反应体系总体积均为25 μL，包括2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物各1.0μL，双蒸水10.5μL。反应程序为：94℃5 min；94℃30 s，退火55℃30 s，72℃1 min，30 个循环；72℃10 min。PCR 扩增产物送英骏生物技术进行测序。

表1 本研究中所用引物及其序列

测序结果使用BioEdit 7.25 修剪低质量序列，然后使用DNAMAN 将序列进行拼接，最后使用Phylosuit 1.2.2进行序列对齐并构建进化树，在ITOL上对进化树进行编辑。

2 结果与分析

2.1 危害症状

该病主要为害槟榔芋球茎，引起芋球茎组织变褐腐烂、变软，植株发黄萎蔫枯萎，后期芋球茎内部组织继续软化、腐败，出现黏液并伴有恶臭味（图1A），有些球茎内部组织干燥发黑，形成空洞，最终全株枯萎死亡。

2.2 病原细菌分离和致病性测定

从广西荔浦槟榔芋栽培区采集到的芋软腐病发病植株，对100 块病组织进行病原菌分离，共分离纯化出4 株菌株，其中一株菌株占比达到85%，将其命名为Pec1 。通过16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，获得大约为1.5 kb 的特异性片段，测序所获得序列经BLAST 分析，结果表明Pec1 与P.subsp.PC1（GenBank Accession No.CP001657.1）的相似度为99.34%。对芋球茎切片组织进行回接菌株Pec1，同时设置空白培养液作对照。结果表明，接种24 h 后，接种菌株Pec1 的芋球茎组织出现水渍状的腐烂症状（图1C），对照芋球茎组织未出现此症状（图1B）。重新分离发病的芋球茎组织上病原菌，结果分离物与接种菌Pec1 培养形态完全一致。将重新分离的病原菌再次用16S rDNA 通用引物进行扩增测序，测序结果进行BLAST，结果与Pec1 的结果一致。可见菌株Pec1 是引起芋软腐病的致病菌。

图1 芋软腐病症状及病原

2.3 菌体形态特征与生理生化特征

菌株Pec1 在NA 培养基上培养48 h，菌落呈圆形或者近圆形，边缘光滑；革兰氏阳性，电镜显微下，菌体为短杆状，无芽孢产生，具鞭毛（图1E）。生理生化测试结果表明菌株可在37℃和厌氧条件下生长，接触酶、氧化酶反应为阳性；不能使山梨醇发酵、木糖发酵、麦芽糖发酵，淀粉水解反应为阴性；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、纤维素二糖，能使明胶液化。以上形态特征与生理生化特征与胡萝卜果胶杆菌subsp.高度相似。

2.4 Pec1 菌株16S rDNA 序列测定分析结果

基于16S rDNA 的进化树显示，Pec1 与subsp.亲缘关系最近，聚在同一簇（图2），但自举支持率仅有69%。通过对icdA、mdh、mtld、proA 四个管家基因进行多基因联合建树，得到图3 所示进化树，由图可知Pec1 与subsp.PC1 仍然聚集在同一簇，并且自举支持率达到99%。

图2 基于16S rDNA 序列进化树分析

图3 基于四个管家基因的多基因序列进化树分析

3 结论与讨论

自2015 年，广西荔浦多个槟榔芋种植区相继出现一种细菌性病害。该病主要为害地下球茎，球茎染病，球茎组织变褐，向内腐烂，球茎迅速软化、腐败，出现黏液并散发恶臭味，最终全株枯萎倒伏死亡，该病严重影响芋头产量和品质。为明确病原分类地位，本研究对芋细菌性软腐病病原菌进行了分离，分离物在NA 培养基上培养48 h，菌落呈圆形或者近圆形，边缘光滑；革兰氏阳性，电镜显微下，菌体为短杆状，无芽孢产生，具鞭毛。经柯赫氏法则验证，分离物接种芋球茎组织引起的腐烂症状与田间芋球茎腐烂症状一致，重新分离发病的芋球茎组织上的病原菌，与原接种物培养形态完全一致，证明了该细菌是引起芋细菌性软腐的致病菌。

经生理生化测定，结果显示该病原细菌可37℃和厌氧生长，可使接触酶、氧化酶反应为阳性，不能发酵山梨醇、木糖、麦芽糖，不能水解淀粉，能使明胶液化；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D－海藻糖、L－鼠李糖、纤维素二糖。这些生理生化特性与胡萝卜果胶杆菌subsp.高度相似。其16S rDNA 序列分析结果显示该病原细菌与subsp.亲缘关系最近，相似度为99.34%，且进化树显示，它们聚在同一簇。并且icdA、mdh、mtld、proA 四个管家基因多基因联合分析也证实Pec1 与subsp.同源性最高。这些信息进一步证明了subsp.为芋细菌性软腐病的病原菌。本研究结果与福鼎市的槟榔芋软腐病的病原鉴定结果一致。

据报道，subsp.（Jones）Bersey et al.称为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病型病原，也可引起槟榔芋软腐病菌。而本研究分离获得的芋（槟榔芋）软腐病病原P.subsp.接种多子芋，也可引起腐烂症状，这证实该病原细菌对芋类作物造成潜在威胁。

由于在细菌分类上是一个大属，本研究获得的subsp.与原先报道的槟榔芋软腐病病原subsp.（Jones）Bersey et al.是否为同一种细菌还需要进一步甄别。

本文通过形态特征观察、生理生化测定和16S rDNA 以及4 个看家基因进行多位点序列分析，鉴定出一株引起芋细菌性软腐病的病原菌subsp.菌株Pec1。研究结果旨在为芋软腐病病原的致病机理研究提供材料以及该病害防治提供理论依据。