芽孢杆菌Bacillus cereus BC-1的烃降解特性研究

张坤成,陶惟一,李 霜

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800;2.南京工业大学 食品与轻工学院,江苏 南京 211800)

随着现代工业的快速发展,石油作为重要的工业原料广泛地应用于材料、能源、化工、医药等领域[1]。然而在石油开采、运输、储存等环节因非正常操作会造成环境污染,一旦石油泄漏到环境中,不仅会造成经济损失,而且对动植物也有着极大的危害[2-3]。目前石油污染的修复技术主要包括物理修复、化学修复以及微生物修复[4]。其中,微生物修复技术主要是利用微生物对石油烃的降解作用去除石油污染物,具有低成本、环境友好等优点,具有较好的应用潜力[5-6]。

微生物修复技术的实施,需要向修复场地添加有活性的高效烃降解功能菌剂;如果烃降解菌株自身难以大规模培养且不易保存活性,则给下游的应用实施带来困难。芽孢杆菌形成的芽孢休眠体对不良环境具有特殊抵抗能力,适合开发成活菌制剂,易于贮存且质量稳定,有利于菌剂由实验室走向实际应用[7]。当前,芽孢杆菌类功能菌株已经应用于生物防治、环境保护、种植业和养殖业等领域[8],具备较为成熟的产业开发经验。芽孢杆菌也是一类重要的烃降解菌株[9],从油污场地中筛选具有烃降解功能的芽孢杆菌并研究其烃代谢特征,有助于促进石油场地生物修复技术的应用实施。

本研究从石油污染土壤中筛选获得了一株能够利用石油为碳源生长的芽孢杆菌,并且对其进行了初步鉴定,研究了其烃降解特征,为开发生物修复菌剂提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验土样

实验土样来自大庆油田长期受石油污染的土壤。取上层石油污染土壤,经粉碎,过筛分装于试管中,置于冰箱备用。

1.2 培养基

Luria-Bertani (LB)培养基(g/L):NaCl 10;蛋白胨 10;酵母粉 5。

无机盐培养基(MSM)(g/L):(NH4)2SO42;NaCl 10;CaCl20.1;K2HPO42.8;KH2PO40.5;MgSO40.1;FeSO40.01;原油1。

1.3 菌种筛选及鉴定

1.3.1 具有原油降解功能的芽孢杆菌筛选

称取0.05 g油污土壤,加到50 mL的MSM培养基中,以1 g/L的原油作为唯一碳源,在20 ℃、150 r/min的恒温摇床中富集培养5 d。将富集培养液转移至85 ℃保温20 min,移取5 mL的富集培养液接入新鲜的MSM培养基中,相同条件下培养5 d,共重复3次。吸取富集后的培养液,稀释适当的倍数,涂布于LB固体培养基,20 ℃培养36 h后,挑取单菌落,接种于LB液体培养基,在20 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养24 h后,以甘油冻存液保藏于-80 ℃冰箱中备用[10]。

1.3.2 菌株的鉴定

将菌液置于载玻片上,利用革兰氏染色试剂对其进行染色,使用显微镜观察菌株细胞形态。利用DNA提取试剂盒提取菌株的基因组,用通用引物27F(5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株16S rDNA进行扩增,并进行测序,测序结果提交至NCBI基因数据库进行比对,使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.4 氮源、温度、pH、NaCl质量浓度、表面活性剂对原油降解效率的影响

将菌株BC-1从-80 ℃冰箱取出,接入LB液体培养基。生长到对数期后在LB固体培养基进行三区划线培养出单菌落,接种BC-1菌株到LB液体培养基,于30 ℃、200 r/min培养24 h得到种子液。

1.4.1 氮源对菌株BC-1原油降解的影响

分别将BC-1种子液接种于MSM培养基、添加2 g/L蛋白胨的MSM培养基和以2 g/L蛋白胨代替(NH4)2SO4的培养基。置于20 ℃、150 r/min培养5 d后,收取发酵液,离心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法测定菌株原油降解率。

1.4.2 温度对菌株BC-1原油降解的影响

将BC-1接种于添加2 g/L蛋白胨的MSM培养基,分别置于20～37 ℃的恒温摇床中。150 r/min培养5 d后,收取发酵液,离心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法测定菌株原油降解率。

1.4.3 pH对菌株BC-1原油降解的影响

添加2 g/L蛋白胨的MSM培养基,调节pH为5～9,接入BC-1种子液。150 r/min培养5 d后,收取发酵液,离心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法测定菌株原油降解率。

1.4.4 NaCl质量浓度对BC-1原油降解的影响

添加2 g/L蛋白胨的MSM培养基,调整NaCl质量浓度分别为0～40 g/L,接种BC-1种子液。150 r/min培养5 d后,收取发酵液,离心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法测定菌株原油降解率。

1.4.5 表面活性剂对菌株原油降解的影响

向添加2 g/L蛋白胨的MSM培养基分别加入200 mg/L的十二烷基磺酸钠(SDS)、Tween 80、鼠李糖脂,接种BC-1种子液。150 r/min培养5 d后,收取发酵液,离心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法测定菌株原油降解率。

1.5 原油降解率测定方法

采用比色法测定原油含量[11]。以不接菌的培养基作为空白对照,向培养液中加入25 mL的石油醚充分混合后,转移到分液漏斗中,充分振荡。再取25 mL石油醚冲洗三角瓶也转移至分液漏斗,再次充分振荡混合。静置,取上层有机相1 mL,稀释100倍,在225 nm下比色测定降解率。

原油降解率=(A0-A1)/A0×100%

式中：A0为空白样的OD225;A1为降解后的OD225。

1.6 菌株BC-1的烃降解特性研究

用2 g/L的柴油或混合烃(C12—C18各300 mg/L;菲、芘各50 mg/L)取代MSM培养基中原油,于150 r/min恒温摇床中培养5 d。采用正己烷萃取有机相。向培养液中加入25 mL正己烷充分混合,转移至分液漏斗中,充分振荡;再取25 mL正己烷冲洗三角瓶后也转移至分液漏斗,再次充分振荡混合。静置,吸取上层有机相1 mL,以无水Na2SO4进行脱水干燥,过有机膜,采用气质联用仪(GC-MS)图谱分析烃降解情况,以角鲨烷作为内标[9]。GC-MS设置电子轰击源EI(70 eV),色谱条件参考Tao等[9]。

1.7 细胞表面疏水性(CSH)测定

将菌株BC-1接种于LB液体培养基中,在30 ℃、200 r/min恒温摇床中培养24 h后,发酵液以8 000 r/min离心弃上清,菌体以质量分数为0.9%的NaCl溶液清洗3次,并以质量分数为0.9%的NaCl溶液将菌体重悬,OD600调整至0.6～0.8。吸取4 mL菌悬液到玻璃试管中,加入1 mL 疏水烃(柴油、正己烷、环己烷、二甲苯),涡旋振荡2 min,静置15 min,移取下相菌悬液,利用紫外分光光度计在600 nm下比色测定吸光率[12-13]。计算细胞表面疏水性。

细胞表面疏水性=(A′0-A′1)/A′0×100%

式中:A′0为涡旋振荡前的OD600;A′1为涡旋振荡后的OD600。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选与鉴定

从大庆油田石油污染土壤中通过富集培养和高温筛选获得了一株能够利用石油为唯一碳源生长的BC-1菌株。其在平板上呈灰白色、扁平、不透明的菌落,表面粗糙呈毛玻璃状;镜检细胞呈长杆状,为革兰氏阳性细菌,进一步通过16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定。

经过16S rDNA测序,提交至NCBI数据库比对后,菌株BC-1鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。通过MEGA 7.0构建系统发育树,如图1所示。

图1 菌株BC-1系统发育树图Fig.1 Phylogenetic tree diagram of strain BC-1

2.2 环境因素对BC-1菌株原油降解效率的影响

2.2.1 有机氮对菌株原油降解的影响

考察BC-1菌株对MSM培养基、添加蛋白胨的MSM培养基以及利用蛋白胨替换(NH4)2SO4的MSM培养基的原油降解率,如图2所示。

图2 氮源对菌株BC-1原油降解效率的影响Fig.2 Effects of nitrogen source on the degradation of crude oil by strain BC-1

氮源对细菌生长代谢具有重要的影响,在微生物修复期间,氮源也是影响修复效果的关键所在。向MSM培养基中添加2 g/L的蛋白胨后,能明显促进菌株BC-1对原油的降解,这可能是因为添加有机氮后促进了菌株的生长,进而提高了菌株的原油降解率[14]。以生物刺激对石油污染场地进行修复是通常采取向污染物场地添加氮源等营养物质来加速修复效率[15]。郭西倩[16]向石油污染土壤(5年以上)中分别添加了KNO3和有机肥,结果表明,KNO3和有机肥在土壤中石油烃的去除率可分别达到40.28%和43.79%。可见,氮源等营养物质在生物修复过程中起着不可替代的作用。

2.2.2 温度、pH、NaCl质量浓度对菌株BC-1原油降解的影响

在微生物修复过程中,微生物的生长往往会受到土壤的温度、pH、土质等环境因素的影响,进而会影响到菌株对原油的代谢[17]。考察温度、pH和NaCl质量浓度对BC-1菌株的原油降解效率的影响,结果如图3所示。

图3 环境因素对菌株BC-1原油降解的影响Fig.3 Effects of environmental factors on the degradation of crude oil by strain BC-1

一般来说,石油污染物场土壤的pH通常在6～9,温度通常在10～45 ℃[18]。土壤环境因素影响着生物修复效果,低温会改变微生物的生理生化性质,导致细胞活力降低,细胞代谢受到抑制,使得烃降解速率降低,修复过程变得漫长[19-20]。因此筛选到能够在低温环境中高效降解石油烃的微生物是进行低温修复的关键所在。菌株BC-1在20～37 ℃温度下的原油降解率均可达到40%以上,在30 ℃原油降解率达到最高49.8%。菌株BC-1在pH 5～9的环境条件下的原油降解率均可达到45%以上,当pH为7时,原油降解率为最高55.25%。尤其值得关注的是,菌株BC-1还具有宽泛的耐盐性能,当NaCl质量浓度在0～30 g/L时,原油降解率均在45%以上。当NaCl质量浓度为10 g/L时,原油降解率可达54.06%。据文献[21]报道,随着土壤盐渍化程度增加,石油烃污染物降解速率会显著降低,持久性也会逐渐增强。菌株BC-1能耐受NaCl质量浓度达30 g/L,意味着该菌株在NaCl质量浓度相对较低的近岸海域也具有较好的环境适应性。以上结果表明菌株BC-1对环境条件不敏感,能够满足石油污染物场地的环境条件,尤其是菌株BC-1的烃降解能力适用于一定的低温和NaCl质量浓度,解决了低温条件下石油去除效率缓慢、微生物活性低等难点。

已报道的具有烃降解功能的芽孢杆菌属菌株较为丰富,尤其是中高温解烃菌较多,表1列举了部分具有原油降解能力的芽孢杆菌及其应用特征。从表1中可以看出,菌株BC-1对环境的适应性较好,在20 ℃低温以及耐盐性方面,BC-1具有较为显著的优势。下一步的工作可以将菌株BC-1进行高密度发酵并制备成菌剂,通过在石油污染场地投放菌剂的方式进行微生物修复,这种修复方法不仅有助于节省人力物力,而且菌株可以快速适应污染物场地的环境条件,从而达到快速修复的效果。

表1 具有烃降解功能的芽孢杆菌及其应用特征

2.2.3 表面活性剂对菌株原油降解的影响

通常来说,表面活性剂具有两亲性,能够减小油水两相之间的斥力,降低界面张力,促进疏水物质的溶解[25]。但表面活性剂自身对细胞也具有一定的毒性,影响菌株对原油的摄取与降解。因此,针对具体的功能菌株,有必要开展表面活性剂的适配性筛选。菌株BC-1自身不能合成表面活性剂,既不能够降低发酵液表面张力,也不能够乳化原油。考察外源添加200 mg/L的表面活性剂对BC-1菌株的原油降解效率影响,结果如图4所示,菌株BC-1的烃降解效率发生了显著变化。

图4 表面活性剂对菌株BC-1原油降解的影响Fig.4 Effects of surfactants on the degradation of crude oil by strain BC-1

由图4可知:生物表面活性剂鼠李糖脂能够显著促进菌株BC-1对原油的降解,能够将原油降解率提高近20%左右;而添加Tween 80后对菌株BC-1的原油降解率并无显著影响;相反,添加SDS后,原油降解率大幅度下降。生物表面活性剂鼠李糖脂对原油降解率的促进效果明显优于化学表面活性剂Tween 80和SDS,这也印证了生物表面活性剂具有更好的生物相容性以及环境友好性,更适用于石油污染的修复治理[26]。

2.3 菌株BC-1的烃降解特性研究

为了解析菌株BC-1的烃代谢特征,采用柴油和混合烃作为降解底物,采用GC-MS分析降解后的组分,计算各种烃的降解率,如图5所示。

由图5(a)可知,菌株BC-1对柴油的降解过程中会优先降解短链烷烃,短链烷烃的降解率明显高于长链烷烃的降解率。菌株BC-1对柴油的平均降解率为63.21%;其中C11—C15的平均降解率为77.93%,C16—C21的平均降解率为49.74%。采用人工构建的C12—C18烷烃以及多环芳烃菲和芘的混合体系为底物时,菌株BC-1同样表现出对C12烷烃的高效降解,如图5(b)所示。菌株BC-1也能够降解多环芳烃;对菲的降解率为30.69%,对芘的降解率为27.01%。以上研究结果表明BC-1对烷烃和多环芳烃均有降解能力,具有优先降解短链烷烃的特点。在后续的工作中,可尝试将BC-1菌株与高效降解长链烃的菌株进行复配,以达到更佳的修复效果。

图5 菌株BC-1的烃降解图Fig.5 Hydrocarbon degradation diagram of strain BC-1

2.4 菌株BC-1的细胞表面疏水性

细胞表面疏水性高低用于评估细胞对疏水烃类的吸附能力。一般来说,当CSH大于80%时,表明细胞是高度疏水的;当CSH小于20%时,表明细胞是高度亲水的[12]。将BC-1在LB培养基中培养24 h后,分别测定BC-1菌株对4种疏水底物的细胞表面疏水性,结果如图6所示。

图6 菌株BC-1对不同疏水底物的细胞表面疏水性Fig.6 Cell surface hydrophobicity(CSH) of strain BC-1 to different hydrophobic substances

菌株BC-1对4种烃的CSH均低于20%,这也表明此时菌株细胞表面是高度亲水的。通常认为,细菌细胞表面的高CSH有助于吸附和摄取烃类;而BC-1作为烃降解菌株,其细胞表面对烃的吸附能力并不强。此前,筛选获得一株具有中高温烃降解功能的枯草芽孢杆菌BL-27也同样具有亲水性细胞表面[13]。因此,笔者认为细胞表面高疏水性可能并不是影响菌株烃降解功能的必要条件。

3 结论

从大庆油田石油污染土壤中,通过高温热处理法筛选获得了一株能够降解原油的土著芽孢杆菌菌株BC-1,经16S rDNA鉴定,该菌株为蜡状芽孢杆菌。BC-1菌株能够满足石油污染场地的环境条件,尤其是其烃降解能力适用于一定的低温和NaCl质量浓度。在最适条件下,BC-1菌株在5 d内对原油降解率可达到55.25%,添加生物表面活性剂鼠李糖脂后能够提升原油降解率至73.8%。基于混合烃底物分析,菌株BC-1可优先降解短链烃,也能降解多环芳烃。芽孢杆菌BC-1具有开发成烃降解菌剂的潜力。