馆藏纸质文物上微生物的分离、鉴定及酶学性质研究——以贵州地区为例

张 诺,陈潇俐,丁丽平,胡 南

(1.纸质文物保护国家文物局重点科研基地,江苏 南京 210016;2.近现代纸质文献脱酸保护技术文化和旅游部重点实验室,江苏 南京 210016;3.南京博物院,江苏 南京 210016;4.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800)

纸质文物作为我国四大发明之中造纸术和印刷术的具体承载,是我国古代劳动人民的智慧结晶与创新成果,占有极为重要的地位与意义。中国两千年以来积累的纸质文物浩如烟海,它真实详细地记录了社会的发展、各地民风民俗等,是祖先留下的宝贵的文化遗产,对于现代学者研究古代历史有着十分宝贵的意义[1]。纸质文物是以纸为主要载体材质的文物,主要包括书画、古籍、档案、地图、文书、纸币、邮票等等。纸张作为纸质文物的载体会因物理、化学和生物因素而损坏,其有机组成成分——纤维素、半纤维素和木质素皆可作为微生物生存必需的碳源。微生物获得这些养分后,生长代谢和繁殖,致使纸张在物理结构、化学组成方面发生不可逆转的“生物退化”[2]。损坏博物馆、图书馆中纸质文物的微生物主要是丝状真菌。丝状真菌在新陈代谢中产生的物质可诱导本体的多种物理和化学分解过程,如:真菌的生长会改变原纸张载体的结构组成,真菌代谢还会产生不同种类的酶系、有机和无机酸、色素、螯合剂和其他生化物质。根据文献[3]报道,有些菌属通过新陈代谢产生的纤维素酶、蛋白酶等,可直接对纸质文物的组成成分进行降解;有些菌属代谢产生的有机酸,黏附在纸质文物上,使纸质文物一直处于低酸度的环境[4],且可以在较短时间大大降低纸张的强度;真菌在生长过程中还会分泌不同颜色的色素,在纸上呈现出从黑色到棕色、红色、黄色和紫色的多种色斑[5],这些色斑会随着时间的推移而增加,最终导致纸质文物无法读视,造成无法挽救的损失。

早在20世纪30年代,人们就注意到纸质文物上出现的黄色、黄褐色、铁锈色的斑点,称之为狐斑(fox spots)[6]。狐斑的起因仍是一个值得讨论的问题。事实上,它的发生有两种互补的理论——生物理论和非生物理论[5]。色斑的颜色代表不同真菌种属的特征,但其出现也可能与纸张特性(酸碱度、金属元素、施胶)相关。关于纸质文物微生物病害的研究方法,基于各类培养基的传统培养方法一直是研究微生物生理代谢特征的主流方法,但分子生物学技术出现以来,包括克隆文库构建、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和分子测序技术在微生物病害鉴定方面发挥了重要作用[7]。近年来,随着宏基因组学、高通量测序、代谢组学、生物化学分析等手段的快速发展,这些与传统培养法将共同构成了研究微生物病害特征和退化机制的“工具库”[7]。

本研究选取贵州地区湿润潮湿气候条件下受微生物侵染的馆藏纸质文物为典型代表;采用无损采样方法对纸质文物表面色斑上的微生物进行采集、分离,结合分子生物学手段对其类别进行基因鉴定;以纤维素酶酶活、木聚糖酶酶活和蛋白酶酶活为评价指标,按照国标定量测定实验菌株的酶活,从而判断因微生物生长增殖和代谢活动对纸质文物可能造成的退化和危害。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

基因组提取采用北京康为世纪生物科技有限公司基因组DNA提取试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司微生物裂解试剂盒;聚合酶链式反应(PCR)扩增引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成;扩增产物的纯化采用江苏康宁生命科学有限公司凝胶回收试剂盒;基因序列测定委托南京金斯瑞生物科技有限公司;蛋白胨、酵母膏、木聚糖,美国阿拉丁公司;羧甲基纤维素钠,生工生物工程(上海)股份有限公司;酒石酸钾钠、L-酪氨酸,BBI生命科学有限公司;葡萄糖、NaCl、琼脂、苯酚、无水亚硫酸钠、二水合磷酸二氢钠、干酪素、七水合硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾,国药集团化学试剂有限公司;福林酚,上海源叶生物科技有限公司。

1.2 培养基[8]

牛肉膏蛋白胨培养基:依次称取蛋白胨10 g、NaCl 10 g、牛肉膏3 g、琼脂15 g于烧杯中,加入适量的双蒸水并加热使其溶解,后定容至1 L,调节pH至7.4～7.6,121 ℃下高压灭菌20 min。液体培养基与固体培养基的成分相同,但不加琼脂。

马铃薯葡萄糖培养基:去皮马铃薯200 g,加适量的水煮沸30 min后,纱布过滤,滤液中加入葡萄糖20 g、琼脂15 g,后定容至1 L,121 ℃下高压灭菌20 min。液体培养基与固体培养基的成分相同,但不加琼脂。

羧甲基纤维素钠发酵培养液基:依次称取羧甲基纤维素钠5 g、七水合硫酸镁0.3 g、硫酸铵2 g、蛋白胨3 g、磷酸二氢钾4 g、NaCl 0.3 g,加入适量的双蒸水后定容至1 L,121 ℃下高压灭菌20 min。

1.3 试样信息

试样(Z1-Z9)为贵州省某博物馆(ZY)馆藏近现代书法、文书。试样(B10-B19)为贵州省某博物馆(BJ)馆藏清代、民国时期书法、绘画。试样表面出现红色、黄色和黑色的色斑,且具有继续恶化的趋势(表1、图1)。

表1 试样基本信息

1.4 试样的理化性质分析

针对试样的病害情况,采用CLEAN pH30型酸碱度计调研色斑区的文物本体酸度值。采用L&W 862型微波水分测定仪调研文物本体的含水率,为病害微生物的生物学特性提供相应的数据支撑。

1.5 微生物的采集、分离和纯化

用浸润的无菌棉签在试样色斑处轻柔旋转摩擦,随即将棉签涂抹及接种至适宜微生物生长的无菌牛肉膏蛋白胨和马铃薯葡萄糖固体培养基上(图2),分别置于37和28 ℃条件下恒温培养箱中培养。分别采用平板划线和点培养法对细菌和真菌进行分离纯化。

1.6 微生物的基因鉴定[8-9]

细菌总DNA的提取采用北京康为世纪生物科技有限公司基因组DNA提取试剂盒,真菌总DNA的提取采用宝生物工程(大连)有限公司微生物裂解试剂盒。

细菌扩增的引物序列为24F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系为50 μL,其中24F和1492R各1 μL、Taq酶0.5 μL、10×PCR缓冲液 5 μL、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL、MgCl24 μL、DNA模板1.5 μL、无菌双蒸水33 μL。PCR反应循环条件为①94 ℃预变性5 min;②94 ℃变性1 min;③55 ℃退火30 s;④72 ℃延伸100 s;⑤重复上述4个步骤35个循环;⑥72 ℃延伸10 min。真菌内源转录间隔区(ITS)基因片段扩增的引物序列为ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR反应体系为50 μL,其中ITS1和ITS4各1 μL、Taq酶0.4 μL、10×PCR缓冲液5 μL、dNTP 4 μL、MgCl23 μL、DNA模板2 μL、无菌双蒸水33.6 μL。PCR反应循环条件为①94 ℃预变性5 min;②94 ℃变性30 s;③58 ℃退火30 s;④72 ℃延伸90 s;⑤重复上述4个步骤35个循环;⑥72 ℃延伸10 min。

将经过酶切验证的质粒试样送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将得到的细菌16S rDNA和真菌ITS序列经过DNAMAN 6.0软件校正后,在GenBank数据库中分别进行同源性序列搜索(BLAST search)。

图1 试样污渍视图Fig.1 Stain views of samples

图2 微生物的采集Fig.2 Collection of microorganisms

1.7 微生物的酶学性质分析

纤维素酶酶活测定:参照中华人民共和国轻工业行业标准QB 2583—2003纤维素酶制剂[10-11]。采用二硝基水杨酸(DNS)法:即以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物,取待测酶液0.5 mL,加入质量分数为1% CMC-Na 1.5 mL,置于50 ℃水浴中反应30 min,加入DNS试剂3.0 mL,摇匀并于沸水中显色10 min,迅速冷却后定容至25 mL。在520 nm下,采用紫外分光光度计测定OD值。葡萄糖标准曲线方程为y=0.837 85x-0.014 45,R2=0.999 4。

木聚糖酶酶活测定:参照中华人民共和国轻工业行业标准QB/T 4483—2013木聚糖酶制剂[12]。采用二硝基水杨酸(DNS)法:即以木聚糖为底物,取待测酶液0.5 mL,加入质量分数为1% CMC-Na 1.5 mL,置于50 ℃水浴中反应30 min,加入DNS试剂3.0 mL,摇匀并于沸水中显色10 min,迅速冷却后定容至25 mL。在520 nm下,采用紫外分光光度计测定OD值。木糖标准曲线方程为y=0.715 61x-0.010 44,R2=0.999 5。

蛋白酶酶活测定:参照中华人民共和国专业标准SB/T 10317—1999蛋白酶活力测定法[13]。即以酪蛋白为底物,取40 ℃预热待测酶液1 mL,加入40 ℃预热的质量分数为2%酪蛋白溶液1 mL,置于40 ℃水浴中反应10 min,迅速加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL终止反应,同时继续水浴中保温20 min。吸取1 mL经12 000 r/min离心机离心10 min的上清液,与0.4 mol/L NaCO32 mL及福林试剂1 mL混合,置于40 ℃水浴中保温发色20 min,迅速冷却至室温。在680 nm下,采用紫外分光光度计测定OD值。酪氨酸标准曲线方程为y=0.009 8x+0.001 27,R2=0.999 5。

2 结果与讨论

2.1 试样的理化性质分析

Z1-Z9、B10-B19色斑处本体纸张含水率平均值皆在10%以上,最高达到18.3%,大部分集中在13%～17%之间(表2),远远超出了纸张正常含水率水平。这与当地潮湿的气候条件和不当的保存环境相关。现场调查发现,库区内未安装任何温度、湿度控制等文物保护的现代化科技设施。这种馆藏环境条件和当地的气候条件给微生物的侵染提供了机会。据文献[5]报道,大多数真菌在0.60～0.98水活度(aw)条件下可以生长,而对于一般真菌,其aw没有明确的极限值,因为它是非常依赖物种的。而对纸张有较大危害的曲霉和青霉可以生长在含水率为7%～8%的本体上,它们在纸张上表现出惊人的生长速度,产生的分生孢子加速了材料的污染。

Z1-Z9色斑处本体纸张的pH平均值在6.2～7.5范围,B10-B19污渍处本体纸张的pH在4.3～5.6范围(表2)。微生物在代谢、繁殖中产生的大量有机酸,如柠檬酸(青霉)、葡萄糖酸(青霉和曲霉)、甲酸、乳酸、延胡羧酸、丙酸、五倍子酸、丁烯二酸(根霉)等黏附于纸质文物上[14],会使纸质文物一直处于低酸度的环境,使纸表面呈暗黄色[4],并可能随着时间的推移而酸化程度增加。

表2 pH平均值、含水率分析结果

2.2 微生物的基因鉴定

试样Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z7、B11、B13、B14、B15、B17、B18、B19污染处黑色色斑占69%、黄色色斑占46%、红色色斑占31%,分离得到可培养物包括33株细菌和42株真菌,通过鉴定实际得到16种细菌和8种真菌;试样Z6、Z8、Z9、B10、B12、B16污渍处未得到可培养物。从细菌鉴定结果(表3)看,侵染纸质文物的细菌主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属和考克氏菌属。其中芽孢杆菌属占33%、假单胞菌属占11%、伯克氏菌属占11%、考克氏菌属占11%。从真菌鉴定结果(表4)看,侵染纸质文物的真菌主要是青霉属、曲霉属和双聚散霉属。其中花斑曲霉F-WY-12-11占21%,青褐双聚散霉CBS 407.87占21%,产黄青霉PO22占17%,产黄青霉MS15占13%,花斑曲霉ATCC 9577菌株占13%。据文献[5]报道,曲霉属和青霉属真菌是侵染纸质文物常见的菌株。青褐双聚散霉尚未在纸质文物侵染菌中报道过,试样Z1、Z3、Z4、Z5、B11中同时被检测出,这可能与当地的气候环境有关。

表3 细菌鉴定结果

表4 真菌鉴定结果

2.3 微生物的酶学性质分析

微生物属于异养型生物,主要依靠酶学系统将胞外的高分子水解成能被微生物的细胞膜所吸收的小分子物质。纸质文物是有机质文物,主要化学成分是纤维素、半纤维素、木质素,它们三者之间形成强大的网络结构。书画文物上作为镶料的绢丝也常成为微生物的侵染对象。唐欢等[15]报道木霉属、青霉属能产生高活性的纤维素酶。据文献[16-17]报道,纤维素酶水解纤维素有很多限制因素,但木聚糖酶对半纤维素中木聚糖组分的酶解有利于纤维素酶的水解作用。Lpez-Miras等[18]采用API-ZYM系统对从油画上分离得到的细菌和真菌的酶活进行了测定。仲雨薇[19]分析了霉斑处碳水化合物的含量,推得霉菌会使纸张中不溶性的纤维素、半纤维素降解成一些可溶性化合物,从而使得被污染处脆化断裂。所以,研究微生物的酶活性及作用是研究微生物致病机制的一个重要方面。为了定量评估分离得到微生物的代谢和破坏能力,测定纤维素酶和木聚糖酶酶活用以了解微生物对纤维素的降解活力,测定蛋白酶酶活用以了解微生物对蛋白质的降解活力。细菌的酶活在细菌OD600为1.1±0.1条件下测定(图3(a)),真菌的酶活在真菌菌体干质量为(2.4±0.1) g条件下测定(图3(b))。结果显示:细菌的纤维素酶酶活和蛋白酶酶活数值皆较低,木聚糖酶酶活为零可忽略不计;芽孢杆菌属的纤维素酶酶活最高,可达2.96 U/mL,动性球菌属的蛋白酶酶活最高,可达4.73 U/mL。真菌的纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活相对较高,蛋白酶酶活为零可忽略不计;曲霉属的纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活皆高于其他菌属,可达18.70和38.02 U/mL;青霉属的酶活次之。由此可知:真菌由于具有较高的代谢酶活较细菌生长繁殖快;真菌中的曲霉属和青霉属酶活总体水平较高,故而成为降解馆藏纸质文物的主要优势微生物。环境中的微生物会在被侵染的材料表面形成生物膜结构,不同微生物之间会释放不同信号以相互“沟通”,例如,芽孢杆菌属的细菌属于产黏液菌,喜好分泌多糖、脂质、腐殖质、蛋白以及核酸的混合物,真菌则会释放一些有机酸如草酸和柠檬酸等螯合剂[20]。因此,细菌和真菌在微生物致病中起到不同的作用,形成协同或竞争代谢。

图3 细菌和真菌酶活测定结果Fig.3 Enzyme activity results of bacteria and fungi

3 结论

本研究检测了贵州省馆藏纸质文物本体的酸度值、含水率;采用无损采样方法,从纸表色斑分离、纯化并鉴定了微生物的菌属;测定了分离得到细菌和真菌的纤维素酶酶活、木聚糖酶酶活和蛋白酶酶活表征“生物退化”活性。

试验表明:1)贵州省馆藏纸质文物本体含水率较高、本体偏酸性,馆藏环境条件和当地的气候条件是导致微生物病害的主要因素;2)实验中共分离得到33株细菌和42株真菌,通过鉴定实际得到16种细菌和8种真菌,芽孢杆菌属、曲霉属、青霉属和双聚散霉属是侵染当地纸质文物的优势菌属;3)细菌的纤维素酶酶活和蛋白酶酶活数值普遍偏低,真菌的纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活相对较高,细菌和真菌对纸质文物都有降解能力,但以曲霉属和青霉属的真菌为主。

纸质文物因其有机组成成分和吸湿性,更易遭到微生物侵染而“生物退化”。随着预防性保护理念的日益深入,找出制约微生物侵染而造成“生物退化”的关键因子将成为预防性保护研究的关键。本研究为揭示馆藏纸质文物生物退化的关键因子提供了相关的数据支撑,为后续预防性保护工作提供依据。