黄芩素通过miR-410/JAK2/STAT3轴对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭及上皮间质转化的影响

曲长萍 田君 霍会蚕 王宁 王晨辉

1河南大学淮河医院妇产科（河南开封475000）；2河南大学（河南开封475000）

宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁女性生命健康，但是目前临床上依然缺乏有效的治疗手段，而且其发生机制复杂，因此寻找安全有效的治疗药物、探讨其发病机制具有重大而深远的意义。黄芩素是从中药黄芩根部提取的一种黄酮类化合物，具有广泛的抗癌作用，不仅可抑制肝癌细胞裸鼠移植瘤生长，而且可以抑制食管鳞癌细胞增殖迁移和侵袭［1-2］。此外，黄芩素对宫颈癌HeLa 细胞的增殖和侵袭具有显著抑制作用［3］。微小RNA（microRNA，miR）-410 在乳腺癌、骨肉瘤以及胰管腺癌等多种恶性肿瘤中被证实具有抑癌作用［4-6］。但是，miR-410 在宫颈癌中的作用鲜有报道，黄芩素能否通过miR-410 发挥抗宫颈癌作用需要进一步探讨，因此本研究以宫颈癌SiHa 细胞为研究对象，探讨黄芩素对SiHa 细胞恶性生物学行为的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人宫颈癌SiHa 细胞购自中国医学科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清和1%链霉-素青霉素的DMEM 培养基中，每2 天更换一次培养基，细胞密度达到80%以上时胰蛋白酶消化传代，取第3 代对数生长期细胞用于实验。

1.2 试剂和仪器 黄芩素购自美国Sigma 公司；NC、miR-410 mimic 和miR-410 inhibitor 购自上海吉玛制药技术有限公司；Janus 激酶2（Janus activated kinase 2，JAK2），信号转导和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），上皮钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、神经钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）以及波形蛋白（Vimentin）抗体购自美国Sigma 公司；多功能酶标仪购自美国Bio-Rad 公司；电泳仪和流式细胞仪购自美国BD 公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。

1.3 MTT 法检测细胞存活率 取第3 代对数生长期SiHa 细胞，制成1 × 105个/mL 的细胞悬液，以每孔200 μL 的量接种于96 孔板，细胞完全贴壁生长后，加入黄芩素浓度分别为0、10、20、40 μmol/L，另设空白孔（仅加入培养液）用于空白对照组，培养24 h 后，加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，培养4 h 后弃掉培养液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡混匀10 min，至于酶标仪上测定490 nm 处的吸光度（A）值，细胞存活率（%）=（实验组-空白组）（/对照组-空白组）×100%。后续用细胞存活率接近50%的黄芩素浓度80 μmol/L 进行实验。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 根据1.3 的方法将细胞进行分组和处理，离心收集细胞，结合缓冲液重悬，加入Annexin V-FITC，孵育15 min 后，加入碘化丙啶，孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 根据1.3的方法将细胞进行分组和处理，将细胞制成细胞悬液，加入Transwell 板上室中，下室中加入含10%胎牛血清的培养基，培养24 h，取出小室，湿棉签擦掉上室多余细胞，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察并拍照。

1.6 细胞分组与转染 将细胞接种于96 孔板，细胞贴壁生长后，随机分为对照组、NC 组、miR-410 inhibitor组和inhibitor+黄芩素组，根据Lipofectamine 2000 说明书将NC 和miR-410 inhibitor 分别转染入对应组别的细胞内，转染24 h 后，inhibitor+黄芩素组细胞加入浓度为80 μmol/L 的黄芩素处理24 h。

1.7 qRT-PCR 检测细胞中miR-410 水平 按1.6的方法进行分组处理，离心收集细胞，Trizol 提取RNA，将RNA 逆转录成cDNA，以cDNA 为模板，根据试剂盒说明书进行操作，2-△△CT法计算miR-410表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 蛋白印迹法检测细胞中各蛋白相对表达量 收集细胞，裂解，测定蛋白浓度，取蛋白样品上样，电泳，湿转，洗膜，抗体孵育蛋白条带，洗膜，二抗室温孵育，洗膜，显色，Image J 分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.9 双荧光素酶报告试验检测miR-410 和JAK2的靶向关系 根据1.3 的方法将细胞进行分组和转染，通过TargetScan 软件预测miR-410 和JAK2 存在结合位点，构建野生型（wt）和突变型（mut）JAK2质粒，将两种质粒与miR-410 mimic 和mimic NC 分别转染入SiHa 细胞，测定荧光素酶活性，结果以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性为报告基因活性。

1.10 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料均以（）描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，之后进行进一步两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度黄芩素对细胞恶性生物行为学的影响 细胞存活率和侵袭细胞数随着黄芩素浓度升高逐渐降低，细胞凋亡率随黄芩素浓度升高逐渐升高，且具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表2 和图1、2。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡率Fig.1 Cell apoptosis rate detected by flow cytometry

表2 不同浓度黄芩素对细胞存活率、凋亡率和侵袭能力的影响Tab.2 Effects of different concentrations of baicalin on cell survival rate，apoptosis rate and invasion ability±s

表2 不同浓度黄芩素对细胞存活率、凋亡率和侵袭能力的影响Tab.2 Effects of different concentrations of baicalin on cell survival rate，apoptosis rate and invasion ability±s

注：与0 μmol/L 组比，aP ＜0.05；与10 μmol/L 组比，bP ＜0.05；与20 μmol/L 组比，cP ＜0.05

黄芩素浓度0 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L F 值P 值细胞存活率（%）96.97±2.13 81.66±2.32a 72.94±3.45ab 62.76±3.15abc 79.354＜0.001细胞凋亡率（%）2.30±0.29 3.77±0.24a 7.51±0.55ab 14.17±0.37abc 579.427＜0.001侵袭细胞数（个）212.05±12.88 159.78±10.12a 115.98±21.32ab 41.32±9.94abc 76.231＜0.001

2.2 黄芩素对EMT 相关蛋白表达的影响 随着黄芩素浓度的升高，E-cad 蛋白相对表达量逐渐升高，N-cad 和Vimentin 蛋白相对表达量逐渐降低（P＜0.05）。见表3 和图3。

图3 细胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoretic diagram of E-cad，N-cad and Vimentin protein expression in cells

表3 各组细胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白相对表达量Tab.3 Relative protein expression levels of E-cad，N-cad and Vimentin in each group ±s

表3 各组细胞中E-cad、N-cad 和Vimentin 蛋白相对表达量Tab.3 Relative protein expression levels of E-cad，N-cad and Vimentin in each group ±s

注：与0 μmol/L 组比，aP ＜0.05；与10 μmol/L 组比，bP ＜0.05；与20 μmol/L 组比，cP ＜0.05

黄芩素浓度0 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L F 值P 值E-cad 0.23±0.03 0.48±0.03a 0.52±0.04b 1.03±0.05abc 228.949＜0.001 N-cad 1.02±0.04 0.24±0.02a 0.27±0.05b 0.13±0.03abc 369.556＜0.001 Vimentin 1.01±0.02 0.42±0.05a 0.37±0.04b 0.25±0.04abc 226.410＜0.001

图2 结晶紫染色观察细胞侵袭（×200）Fig.2 Crystal violet staining for cell invasion（×200）

2.3 qRT-PCR 和蛋白印迹法检测结果 与对照组和NC 组比较，miR-410 inhibitor 组miR-410 表达水平降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与miR-410 inhibitor 组比较，inhibitor+黄芩素组miR-410 水平升高，p-JAK2 和p-STAT3 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。对照组和NC 组miR-410 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4 和图4。

图4 细胞中p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoretic diagram of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 protein expression in cells

表4 各组miR-410 水平以及p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白相对表达量比较Tab.4 Comparison of miR-410 levels and relative protein expression levels of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 in each group±s

表4 各组miR-410 水平以及p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白相对表达量比较Tab.4 Comparison of miR-410 levels and relative protein expression levels of p-JAK2，JAK2，p-STAT3 and STAT3 in each group±s

注：与对照组比，aP ＜0.05；与NC 组比，bP ＜0.05；与miR-410 inhibitor 组比，cP ＜0.05

组别对照组NC 组miR-410 inhibitor 组inhibitor+黄芩素组F 值P 值miR-410 6.51±0.57 6.94±0.43 3.19±0.40ab 14.36±0.79abc 206.135＜0.001 p-JAK2 0.59±0.03 0.62±0.04 0.83±0.05ab 0.22±0.03abc 130.780＜0.001 JAK2 0.79±0.04 0.77±0.02 0.82±0.02 0.83±0.02 3.250 0.081 p-STAT3 0.72±0.03 0.70±0.06 0.89±0.04ab 0.27±0.04abc 108.727＜0.001 STAT3 0.88±0.02 0.89±0.03 0.90±0.02 0.94±0.02 3.952 0.053

2.4 双荧光素酶报告实验检测结果 JAK2-wt+miR-410 mimic 共转染组细胞荧光素酶相对活性低于NC 共转染组（P＜0.05），而JAK2-mut+miR-410 mimic 共转染组和NC 共转染组细胞荧光素酶相对活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5 和图5。

表5 荧光素酶相对活性Tab.5 Luciferase relative activity ±s

表5 荧光素酶相对活性Tab.5 Luciferase relative activity ±s

组别JAK2-wt+NC 组JAK2-wt+miR-410 mimic 组t 值P 值JAK2-mut+NC 组JAK2-mut+miR-410 mimic 组t 值P 值荧光素酶相对活性1.71±0.11 0.41±0.10 15.146＜0.001 1.70±0.10 1.71±0.09 0.129 0.904

图5 JAK2 和miR-410 的结合位点序列Fig.5 Binding site sequence of JAK2 and miR-410

3 讨论

目前临床上常采用手术切除、辅以放化疗为治疗宫颈癌的主要手段，但是术后复发、转移是患者死亡的主要原因，也是治疗面临的最大难题［7］。黄芩素已被发现具有多种药理学活性，黄芩素可抑制压力诱导的椎间盘随和细胞凋亡，延缓椎间盘退变［8］。黄芩素通过诱导宫颈癌细胞凋亡发挥抗宫颈癌作用已被广泛报道［9-11］。因此本研究主要探讨黄芩素对宫颈癌SiHa 细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。通过不同浓度黄芩素处理细胞后，细胞存活率和侵袭能力随黄芩素浓度的升高逐渐降低，细胞凋亡率随黄芩素浓度的升高逐渐升高，且具有浓度依赖性。由此可见，黄芩素可抑制宫颈癌SiHa 细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，降低癌细胞侵袭能力。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在一定的生理或病理状态下丧失上皮细胞极性，逐渐获得间质细胞表型的现象，发生EMT 的上皮细胞经结构改变后，极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，从而获得更强的迁移和运动能力，同时上皮表型，如角蛋白丝和E-cad 逐渐丧失，而间质表型，如Vimentin、N-cad 和纤维连接蛋白等表达［12-13］。EMT 与宫颈癌的浸润和迁移密切相关［14-15］。本研究结果显示：随黄芩素浓度的升高E-cad 蛋白表达升高，N-cad和Vimentin 蛋白表达降低，由此可见，黄芩素可抑制宫颈癌SiHa 细胞发生EMT。

研究发现，miR-410 可通过靶向Snail1 蛋白的表达解除免疫抑制并抑制宫颈癌HeLa 细胞生长、迁移和侵袭［16］。为进一步探讨黄芩素抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭，诱导癌细胞凋亡的具体机制，本研究通过抑制SiHa 细胞中miR-410 表达同时，给予黄芩素处理，结果显示：inhibitor 组细胞中miR-410 的表达降低，黄芩素可逆转miR-410 表达水平，结果表明：黄芩素可上调SiHa 细胞中miR-410 表达。STAT3 是一个胞质转录因子，被JAK 家族的酶激活后，参与调节细胞因子和生长因子信号，JAK2/STAT3 信号通路参与调节多种恶性肿瘤的发生发展，阿魏酸钠使JAK2/STAT3 信号通路失活可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭［17］。IL-6 通过激活JAK2/STAT3 信号通路可促进胃癌细胞发生EMT 和转移［18］。SHEN 等［19］研究发现MUC16 通过JAK2/STAT3 磷酸化介导环氧化酶2 表达促进宫颈癌进展。大豆苷元通过抑制JAK2/STAT3 信号通路可阻碍宫颈癌细胞生长，诱导癌细胞凋亡［20］。本研究通过双荧光素酶报告试验检测到miR-410可直接靶向作用于JAK2，此外，蛋白印迹法检测结果显示：inhibitor 组p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达升高，给予黄芩素后p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达低于inhibitor 组。以上结果表明，黄芩素上调miR-410 表达介导JAK2/STAT3 信号轴发挥抗宫颈癌作用。

综上所述，黄芩素可抑制宫颈癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，逆转癌细胞EMT 过程，其可能是通过上调miR-410 表达，抑制JAK2/STAT3 信号轴发挥作用。本研究仍存在不足之处，首先本研究仅在细胞水平上进行，缺少动物实验的佐证；其次，癌症的发病机制复杂，本研究探讨不够深入，下一步将从多角度进行深入探讨和分析。