沙库巴曲缬沙坦对慢性心力衰竭兔心室重构的影响

刘立天 王家琦 谢悦陶 张飞飞 党懿 齐晓勇

1河北省人民医院心血管内科（石家庄050051）；2河北北方学院研究生院（河北张家口075000）

心力衰竭（heart failure，HF）是导致死亡的主要原因之一，严重增加了社会经济负担。心力衰竭是由于心脏结构和/或功能异常导致充盈和/或射血能力受损以致不能满足机体供血需求的一种临床综合征［1-2］。沙库巴曲缬沙坦作为一种血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂，可阻滞血管紧张素Ⅱ受体和抑制脑啡肽酶，抑制细胞肥大，发挥扩张血管、利钠、利尿、改善心肌重构作用［3-5］，以其独特的作用机制给心衰的治疗带来了新的希望［6］。但其疗效观察的依据还较为匮乏，急需进一步阐释其具体机制并评估该药的安全性及有效性。本研究通过建立慢性心力衰竭兔模型后给予沙库巴曲缬沙坦干预，通过观察及测定心脏彩超、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、心肌组织病理、Ⅰ型胶原（collagenⅠ，ColⅠ）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ，ColⅢ）、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidases，MMP）及TGFβ/Smad 信号通路表达，探讨沙库巴曲缬沙坦对慢性心衰心室肌重构的影响及其机制，旨在为临床更好地治疗心力衰竭提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔30 只，雌雄不限，体质量约3.0～3.5 kg，实验动物均购自河北医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（冀）2016-002。饲养于河北省人民医院临研中心动物房，室温条件下分笼饲养。本研究已经过本院动物伦理委员会审查。

1.2 主要仪器和试剂 注射用青霉素钠160 万单位/支购自华北制药有限公司，戊巴比妥钠，液氮，4%甲醛，沙库巴曲缬沙坦100 mg/片购自北京诺华制药有限公司，兔N 末端脑钠肽前体（N-terminal proBNP，NT-proBNP）试剂盒购自武汉优尔生科技有限公司，抗TGF-β 抗体购自博士德生物工程有限公司，抗α-SMA 抗体购自莱恩生物科技有限公司，抗Col-1 及抗Col-3 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗为山羊抗兔抗体购自易瑞生物技术有限公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 建立慢性心力衰竭动物模型 用3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）通过耳缘静脉注射，充分麻醉后，将兔固定于动物手术台，备皮并消毒后于胸骨左缘肋间区打开胸腔，充分暴露心脏，在升主动脉根部远端1 cm 处游离约3～5 mm，于游离处环扎升主动脉使其为原周长60%，关闭胸腔。术后3 d均给予注射用青霉素钠1.6 × 106U 肌肉注射。以术后12 周出现进食减少、精神差等心衰症状同时行心脏彩超示左室射血分数≤40%视为慢性心力衰竭模型制作成功。

1.3.2 实验分组及干预 30 只新西兰大白兔随机分为3 组：假手术组开胸但未行升主动脉环扎术；心衰组开胸并环扎升主动脉；沙库巴曲缬沙坦组行开胸、环扎升主动脉并于慢性心衰模型制作成功后给予8 周的沙库巴曲缬沙坦治疗。假手术组因出血死亡1 只，心衰组因急性左心衰竭死亡1 只，沙库巴曲缬沙坦组实验动物因麻醉意外死亡2 只。最终假手术组、心衰组存活9 只，沙库巴曲缬沙坦组存活8 只。心衰组、沙库巴曲缬沙坦组实验动物均满足心衰标准，并于术后12 周模型制作成功后，予以沙库巴曲缬沙坦组以每天10 mg/kg沙库巴曲缬沙坦（北京诺华制药有限公司，国药准字J20171054，规格：100 mg×14 片），进行8 周灌胃干预。心衰组及假手术组均给予8 周生理盐水灌胃。

1.3.3 心脏彩超检测 药物干预8 周末，使用IU22彩色超声仪检查心脏彩超，于M 型图像测定各组左室舒张末内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室缩短率（fractional shortening，LVFS）和左室收缩末内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）。以上各测量值连续测量3 次取平均值。

1.3.4 血清NT-proBNP检测 药物干预8周末，经兔耳缘静脉取血5 mL，使用离心机以3 000 r/min 离心10 min，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）检测各组血清NT-proBNP水平。

1.3.5 HE 染色及Masson 染色 药物干预8 周末完成心脏彩超检查后，处死同时留取各组实验动物心肌组织标本，使用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋心肌组织后切取5 μm 厚切片，并进行Masson 染色及HE 染色，在光镜下观察各组心肌组织病理形态及纤维化程度。在Masson 染色后胶原纤维呈现绿色，采用Image Pluse6.0 软件分析检测各组心肌组织胶原纤维。

1.3.6 Western blot 采用Western blot 法检测α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7 蛋白表达水平。将蛋白样品加入凝胶孔中，根据蛋白定量结果，加入5 ×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液与20 μg 相应体积的总蛋白样品并混合，应用SDS-PAGE 凝胶于95 ℃变性10 min 后进行电泳。电泳结束后，采用转移电泳将分离得到的蛋白条带转印至PVDF 膜上，并分别使用非标记一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育并检测。将转移膜放入室温摇床上的封闭液中封闭缓慢摇动1 h，将封闭的转移膜放入一抗工作液中在4 ℃反应过夜，之后取出反应膜放入平皿并充分洗去游离二抗，曝光洗片后，使用Image J 软件分析各样本的灰度值。

1.4 统计学方法 使用统计软件SPSS 26.0 进行各组数据的统计分析。采用均数±标准差表示各组计量数据，采用方差分析及SNK-q检验比较各组组间均数。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏彩超检测结果 药物干预8 周后，与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组的LVFS、LVESD 及LVEF 指标明显改善（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 各组心脏超声图像Fig.1 Echocardiographicindifferentgroup

2.2 各组血清NT-proBNP 检测结果 药物治疗8 周后，与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组血清NT-proBNP 水平明显降低，但仍明显高于假手术组（P＜0.05）。见表1。

表1 药物干预后心脏彩超及NT-proBNP 检测结果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

表1 药物干预后心脏彩超及NT-proBNP 检测结果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

注：LVESD 为左心室收缩末期内径、LVEDD 为左心室舒张末期内径、LVEF 为左心室射血分数、LVFS 为左心室短轴缩短率；NT-proBNP为N 末端B 型利钠肽原；与假手术组相比，aP ＜0.05；与心衰组相比，bP ＜0.05

指标LVESD（mm）LVEDD（mm）LVEF（%）LVFS（%）NT-proBNP（ng/mL）假手术组（n=9）6.78±0.833 11.06±0.73 57.56±5.41 34.56±2.59 296.36±18.05心衰组（n=9）12.44±1.01a 12.50±0.61a 35.56±2.70a 17.17±1.85a 391.59±28.35a沙库巴曲缬沙坦组（n=8）10.38±0.92ab 12.00±2.00 45.00±2.51ab 25.69±1.51ab 343.71±11.35ab F 值86.447 3.155 74.904 161.021 47.229 P 值＜0.001 0.062＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 各组心肌组织病理检查结果 药物干预8 周后，心肌组织HE 染色示心衰组心肌组织肌纤维排列紊乱，细胞肥大。沙库巴曲缬沙坦组较心衰组改善。Masson 染色示与假手术组相比，心衰组胶原纤维含量明显增加（P＜0.05），沙库巴曲缬沙坦组心肌组织胶原纤维沉积较心衰组明显下降（P＜0.05）。Masson 染色后心肌组织中的胶原纤维呈绿色，肌纤维及纤维素则呈红色。Masson 染色结果显示，与假手术组相比，心衰组心肌组织中胶原纤维含量明显增加［（10.01 ± 1.74）%vs.（4.36 ±0.93）%，P＜0.05］，沙库巴曲缬沙坦组心肌组织胶原纤维沉积较心衰组明显下降［（10.01 ± 1.74）%vs.（5.43±1.12）%，P＜0.05］。见图2。

图2 HE、Masson 染色下的心肌组织病理（×200）Fig.2 Pathological of myocardial tissue in HE and Masson staining（×200）

2.4 心肌组织蛋白表达水平 各组心肌组织蛋白表达水平比较，与假手术组比较，心衰组α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白表达水平显著升高，Smad6、Smad7 蛋白表达下降；与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组心肌组织中α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TGFβ、Smad2 及Smad3 蛋白表达水平显著降低，Smad6及Smad7 蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3 及表2。

表2 心肌组织的蛋白表达水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

表2 心肌组织的蛋白表达水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

注：与假手术组相比，aP ＜0.05；与心衰组相比，bP ＜0.05

指标α-SMA ColⅠColⅢMMP2 MMP9 TIMP1 TGF-β Smad2 Smad3 Smad6 Smad7假手术组（n=9）7 980.67±1 155.52 18 619.00±869.36 9 052.89±586.32 15 379.78±1 000.08 19 689.44±1 346.57 20 513.00±1 232.67 11 815.56±1 253.84 16 343.78±1 754.83 15 388.00±2 026.15 19 552.22±2 272.11 20 549.89±3 306.26心衰组（n=9）21 553.00±2 858.89a 23 448.56±867.52a 13 908.11±923.44a 18 976.33±1 741.46a 26 976.11±1 877.52a 26 031.89±3 309.79a 18 552.56±1 104.66a 21 439.44±962.25a 22 107.78±5 133.34a 14 366.56±696.02a 13 504.89±1 751.67a沙库巴曲缬沙坦组（n=8）17 779.25±2 993.95ab 20 893.38±603.69ab 10 732.38±835.77ab 16 862.13.33±984.47ab 24 287.75±1 328.96ab 24 261.25±3 788.78 15 044.88±2 910.96ab 20 113.50±750.32ab 16 922.38±1 029.54ab 16 655.13±2 066.66ab 16 713.88±2 175.02ab F 值72.837 82.658 86.820 17.306 50.950 8.181 28.780 39.986 10.153 18.615 17.743 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001 0.002＜0.001＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

图3 心肌组织蛋白Western blot 图Fig.3 Western blot map of myocardial tissues Protein

3 讨论

心肌重构是慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）发生发展的重要机制，是以神经内分泌及血液动力学共同介导，可引起胶原纤维增加以及心肌细胞肥大、凋亡、坏死，出现瘢痕形成及心肌纤维化，进而发生心室壁肥厚。室腔形态改变及顺应性降低，心功能逐渐进入失代偿期，最终导致心力衰竭发生［7］。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活在HF 心室重构中发挥着重要作用，可激活成纤维细胞使胶原纤维合成增多，并可作用于基质金属蛋白，影响心肌组织细胞外基质的降解，进而影响心肌细胞凋亡及蛋白合成。研究表明，利钠肽系统对RAAS 具有抑制作用，具有利钠及扩张血管作用，可改善心室组织纤维化及重构［8-9］。

LEE等［10］研究发现，非缺血性心肌病患者经沙库巴曲缬沙坦治疗后，LVEF明显改善。沙库巴曲缬沙坦可改善HF 患者NT-proBNP、LVEF、LVEDD［11-12］，并可降低HF 患者再次住院率及死亡率［4］。本研究通过升主动脉根部套扎法成功建立CHF 动物模型，并根据既往相关研究中以10 mg/kg 沙库巴曲缬沙坦给予HF 新西兰兔可平衡利钠肽系统与RAAS 为基础给予干预［13］，研究结果与既往研究一致，给予CHF 兔8 周沙库巴曲缬沙坦治疗可改善LVFS、LVESD 及LVEF，降低血清NT-proBNP 水平，明显改善心功能。

研究发现影响心脏纤维化和心肌重塑的信号蛋白，主要包括TGFβ/smad 家族成员2/3、ColⅢ、磷脂酰肌醇3-激酶、细胞外信号调节激酶、MMP2、MMP9 及TIMP1，其中Smad 信号级联在心脏纤维化反应中起着关键作用［14-15］。BURKE 等［16］研究表明沙库巴曲缬沙坦对HF 大鼠心肌组织中成纤维细胞有明显抑制作用，可明显改善因心脏后负荷增加而引起的心肌组织纤维化。本研究结果与既往研究一致，HE 染色结果表明，沙库巴曲缬沙坦可降低心肌细胞变形坏死及炎细胞浸润程度，并可改善HF 心肌组织中心肌纤维排列。胶原纤维蛋白沉积增加是心肌纤维化的重要评价指标，Masson 染色结果显示HF 心肌组织胶原纤维增生，且呈网状分布于心肌纤维束之间，沙库巴曲缬沙坦可改善CHF 兔心肌纤维化程度。正常心肌组织中胶原纤维主要由成纤维细胞分泌，在CHF 等病理状态下，成纤维细胞可增生并转化为肌成纤维细胞，其合成细胞外基质的能力明显提高，在心肌组织纤维化过程中发挥重要作用，α-SMA 是区分纤维细胞与肌成纤维细胞的重要分子［17］。有研究表明，应用腹主动脉环扎法建立的慢性心力衰竭大鼠模型，检测MMP2、MMP9、ColⅠ和ColⅢ蛋白表达明显增加，并可出现心功能不全及心脏结构改变，提示其导致心室肌重构的机制为促进成纤维细胞增殖及胶原纤维沉积［18］。研究表明沙库巴曲缬沙坦可改善心肌重构，降低死亡率，改善临床预后［19］。本研究采用Western blot 技术发现慢性心衰兔心肌组织中MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表达明显增加，而Smad6、Smad7 蛋白表达降低；沙库巴曲缬沙坦可明显降低MMP2、MMP9、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表达水平，并可明显提高Smad6 及Smad7 蛋白的表达水平。

在生理状态下，TGF-β可提高Smad7表达水平，TGFβ/Smad 信号转导受Smad7 负反馈调节。研究发现Smad7 蛋白表达增加，可减少由TGF-β 诱导的肌成纤维细胞分化，并可减少成纤维细胞合成胶原纤维［20］。本研究证实，在心衰组心肌组织中，TGF-β、Smad2 及Smad3 表达较假手术组明显升高，Smad6、Smad7 表达减少，提示慢性心衰心肌组织中TGF-β/Smad 信号转导增强，Smad7 对纤维化抑制作用减弱。

综上，本研究发现沙库巴曲缬沙坦可通过调节HF 心肌组织TGFβ/Smad 信号通路影响胶原纤维的沉积、降解，降低心肌纤维化，改善慢性心衰兔心室肌重构。