牙周膜HMGB1、骨膜蛋白表达水平与正畸牙移动过程的相关性分析

高再冕，高雅丽

（平顶山学院第二附属医院 平顶山市口腔医院1.口腔正畸科；2.牙体牙髓科，河南 平顶山467000）

口腔正畸是一种借助机械外力促进牙齿畸形患者压力侧骨吸收,而张力侧新骨沉积的移位矫形的口腔治疗技术[1]。 正畸牙受矫治力作用后，早期是个急性炎症的过程,牙周组织合成与释放多种因子[2]。 最近的研究发现高迁移率族蛋白1（HMGB1）是牙周炎症及骨组织改建的重要介质， 其还与成纤维细胞增殖、分化的重要参与因子[3]。 骨膜蛋白（Pn） 是新发现的一种多功能的细胞外基质蛋白。研究认为[4]，Pn 是对牙周膜稳态调节有关键作用的细胞外基质蛋白。 但临床对HMGB1、Pn 在各牙周疾病中表达水平及临床意义研究较少。 因此本研究探讨牙周膜高迁移率族蛋白1（HMGB1）、骨膜蛋白（Pn）在正畸牙移动过程中的表达及意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取清洁型C57BL 小鼠12 只，雌雄各半，7 周龄，体质量17～20 g，在室温18～25℃，相对湿度50～80%条件下饲养， 明暗周期为12 h，标准饲料喂养，自由摄食和饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠牙齿移动模型建立 本实验采用Waldo法建立牙齿正畸移动模型，C57BL 小鼠适应性饲养一周，称重后腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，小鼠固定后取仰卧位，暴露小鼠口腔。 用眼科镊将皮条塞至小鼠牙齿之间， 以右侧上颌第一磨牙远中根及周围牙周组织为观察组（近中为压力侧、远中为张力侧），左侧上颌作为对照组。

1.2.2 组织学观察 各组动物在建模7 d 后处死，取双侧上颌磨牙及其周围组织，福尔马林固定。 脱钙处理48 h 后清水冲洗，选用10% EDTA 进行脱钙处理，时长约为30 d，每隔3 d 更换一次脱钙液。大头针能无阻力穿过组织为脱钙完成标准[5]。 脱钙后选用酒精进行梯度脱水处理，共7 个梯度，每个梯度脱水6 h。 蜡缸浸渍3 h， 组织包埋后切片处理。 取含有第一磨牙近远中根及其周围组织的切片展开，置于37℃烤箱烤干过夜备用。

1.2.3 免疫组化检测 采用免疫组化SP 法。HMGB1、Pn 一抗（HMGB1：兔来源单克隆抗体，浓度1∶250， 购自Abcam 公司；Pn： 兔来源多克隆抗体，浓度1∶500，购自Abbkine 公司）；生物素标记二抗（山羊抗兔IgG 多克隆抗体，浓度1∶1000，购自Abcam 公司）。

读片评分标准：（1） 根据着色强度：0 分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为褐、 黑色；（2）根据阳性细胞比例：阳性细胞数目占比≤10%计1 分，阳性细胞占比为11%～50%计2 分，阳性细胞数占比为51%～75%计3 分， 阳性细胞数占比＞75%计4 分。 两种积分相乘总分＜3 分视为阴性，≧3 分视为阳性。

Western blot 法检测HMGB1、Pn 表达：均按试剂使用说明常规进行HMGB1、Pn 蛋白的提取、电泳、封闭、一抗及二抗孵育、显色；应用激光成像系统进行扫描并用电脑图像分析系统进行数字化信息转化， 记录条带光密度对HMGB1、Pn 表达进行评价。

1.2.4 RT-PCR 检测 采用Trizol 法提取组织样本的总RNA， 参照逆转录试剂盒说明书要求快速将其反转录为cDNA， 以cDNA 为模板， 参考RTPCR kit 说明书完成逆转录反应合成TGF-1 mRNA、FAK mRNA，取出产物4℃下放置5 min。 常规进行PCR 产物电泳、染色，在紫外投影仪下进行观察，并应用凝胶成像系统TGF-1 mRNA、FAK mRNA 及内参照基因GAPDH 的DNA 条带进行灰度值分析，TGF-1 mRNA、FAK mRNA 的相对表达量为各mRNA 的条带与GAPDH 的DNA 条带的灰度值比值。

1.3 统计学处理 应用采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，计量资料采用（±s)表示，组间比较使用方差分析， 两两比较采用LSD 检验。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色结果 对照组牙周纤维排列整齐，牙槽骨平整，胶原纤维自牙骨质伸入牙周膜，牙周膜大部分有胶原纤维和成纤维细胞组成。 实验组张力侧牙周间隙变宽，牙周膜纤维排列不整齐，压力侧牙周间隙变窄，有部分透明样变区，骨有大量多核的破骨细胞聚集在吸收陷窝内。 见图1。

图1 HE 染色

2.2 各组HMGB1、Pn 表达比较 观察组压力侧HMGB1 光密度值为明显低于观察组张力侧和对照组（P＜0.05），而Pn 光密度值明显高于观察组张力侧和对照组（P＜0.05）； 观察组张力侧与对照组HMGB1 和Pn 光密度值比较， 差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 各组HMGB1、Pn 表达比较

图2 免疫组化检测

2.3 各组TGF-1、FAK mRNA 表达比较 观察组压力侧TGF-1、FAK mRNA 相对表达量均明显高于观察组张力侧和对照组（P＜0.05）；观察组张力侧与对照组TGF-1、FAK mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表2 各组TGF-1 mRNA、FAK mRNA 相对表达比较

3 讨论

口腔正崎是牙齿畸形，尤其是牙齿排列不齐、牙齿形态异常的常用治疗方案[6]。 整个正畸工作具有生物力学阶段和生物学两个阶段， 其中生物力学阶段需借助机械外力，将错位牙、牙弓及颌骨进行移位矫形； 生物学阶段则表现为机械外力作用下，牙周组织微结构的改建。 这一微结构改建主要存在于牙周组织、牙槽骨内，改建时牙周局部将合成并释放多种因子，进而刺激多种细胞发生应答，最后促使牙齿移位，实现正畸效果[7]。

牙周膜（Periodontal ligament）位于牙根与牙槽骨之间，为连接牙齿与牙槽骨的桥梁，主要为胶原纤维，多集合成束。 研究显示[8]，牙周膜是牙周组织损伤或修复的重要组织，正畸治疗时，牙周膜将感应到的应力信号转化为生物学信号， 完成牙周组织的改建。 这一过程与多种细胞因子及信号通道有关[9]。 高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种非组蛋白染色体结合蛋白， 广泛存在于在真核细胞的细胞核内。近年来关于HMGB1 与牙齿移动的关系受到广泛的关注。 既往研究显示[10]，软骨细胞合成的HMGB1 对成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞具有极强的趋化效应。机械应力的刺激使HMGB1 在牙周膜中的表达受到影响[11]。 本研究中，观察组压力侧HMGB1 光密度值明显低于观察组张力侧和对照组（P＜0.05），表明牙周膜HMGB1 可能参与了正畸牙移动过程中牙周膜改建。

骨膜蛋白(Periostin，Pn)是一种多功能的细胞外基质蛋白，在骨合成代谢、骨折修复、骨的生长发育及骨强度维持方面起重要作用[12]。 近年来对Pn 研究显示[13]，Pn 对牙周组织的完整性、牙齿的发育和萌出发挥着重要的作用。 因此Pn 可能对正畸牙移动中牙周组织的改建起着关键作用。 Sriram[14]等研究发现， 敲除基因的小鼠牙周组织出现明显破坏、牙周附着降低、牙槽骨吸收。 越来越多的研究认为，Pn 是评价牙周膜细胞特性的关键因子，但其对牙周组织改建的影响如何，临床研究较少。 基于此，本研究探讨Pn 在正畸牙移动过程中的表达及意义， 用以探究正畸过程中牙周组织改建的分子机制。 研究结果显示，观察组Pn 光密度值明显高于观察组张力侧和对照组（P＜0.05）；说明正畸牙齿移动过程中，Pn 在牙周膜的表达明显增强，Pn在牙周膜细胞外基质改建发挥重要作用。 研究显示[15]，Pn 与多个系统性疾病有关，而其表达水平则与TGF-β1 存在密切联系， 会涉及FAK 依赖的通路的调节。 骨组织的改建过程中，骨新生与骨吸收处于动态平衡， 其中个别细胞因子在其中起到重要作用。TGF-β1 分布于动物的正常组织和转化细胞中，在骨及骨环境的递质中广泛存在。 为了更好的了解与正畸牙周组织骨改建的关系， 本研究使用RT-PCR 检测TGF-β1、FAK mRNA 表达， 结果显示， 观察组压力侧TGF-β1、FAK mRNA 相对表达量明显高于观察组张力侧和对照组（P＜0.05）。结果表明PN、TGF-β1、FAK 是正畸力的转化为生物信号的效应因子，均参与牙周膜改建的过程。 但是FAK 信号通路在其中参与的调控机制， 还需要进一步研究验证。

综上所述， 牙周膜HMGB1 和Pn 可能参与了正畸牙移动过程中牙周膜改建，值得进一步研究。