造血干细胞移植治疗对再生障碍性贫血患者外周血Treg 细胞及TGF-α、G-CSF 水平的影响

周航，贾冉，黄金

（南阳市中心医院血液内科，河南 南阳473000）

再生障碍性贫血是由于多因素作用引发的一种非恶性血液病，患者会出现造血功能损伤、外周血全血细胞减少、贫血等情况。 目前，造血干细胞移植治疗仍是临床用于彻底治愈再生障碍性贫血的最有效的方法之一[1-2]。 骨髓干细胞有高度自我更新、分化的能力，可分化为各血细胞系统的祖细胞， 且造血能力极强， 可达到正常造血情况的9倍， 因此， 用于治疗再生障碍性贫血有很好的疗效。 脐带血造血干细胞和骨髓造血干细胞移植均是临床常用的干细胞移植治疗再生障碍性贫血的方法[4-5]。 有研究显示，脐带血中含有多种有益的细胞，如调节性T 细胞等。 脐带血造血干细胞分化潜能极高，增殖能力优于骨髓造血干细，且取材更加方便。 因此，脐带血造血干细胞治疗再生障碍性贫血的应用逐渐广泛[6]。 再生障碍性贫血患者常见免疫功能紊乱，T 细胞亚群出现异常， 对患者外周血调节性T 细胞（regulatory Tcell，Treg）细胞以及多种细胞因子的观察具有明显意义[7]。 本研究探讨了造血干细胞移植治疗对再生障碍性贫血患者外周血Treg 细胞及转化生长因子 （transforming growth factor-α，TGF-α）、 粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）水平的影响，为提高再生障碍性贫血治疗疗效提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年2 月至2020 年2 月我院确诊的再生障碍性贫血患者且接受非血缘造血干细胞移植治疗患者70 例，男39 例，女31 例，年龄20～65 岁，平均年龄（41.65±19.74）岁。 纳入标准：（1）符合《再生障碍性贫血的诊断和治疗指南》[8]中的再生障碍性贫血诊断标准；（2）经骨髓穿刺、活检等确诊为再生障碍性贫血；（3）经家属和患者知情同意；（4）医院伦理委员会通过。 排除标准：（1）存在严重感染或出血情况且病情不可控制的患者；（2）存在其他血液疾病的患者；（3）严重高血压、心脏病以及合并恶性肿瘤患者。 患者中接受非血缘脐带血造血干细胞移植患者33 例作为观察组，男20 例，女13 例，年龄20～65 岁，平均年龄（41.33±19.02）岁。 接受非血缘骨髓造血干细胞移植37 例作为对照组，男19 例，女18 例，年龄20～65 岁，平均年龄（41.93±19.94）岁。 两组患者性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 治疗方法 预处理方案：根据患者个体特异性选择与处理方案。 方案一： 采用环磷酰胺50 mg（kg·d）；抗人胸腺球蛋白20 mg（kg·d），均使用4 d，静脉滴入。 方案二：口服马利兰5 mg（kg·d），3 d；静脉滴入Cy 1.8 g( m2·d) ，3 d；静脉滴入阿糖胞苷2 g ( m2·d) ，使用时间为20 h。

观察组患者接受非血缘脐带血造血干细胞移植治疗。 根据冻存前脐血（北京脐血库）有核细胞数和CD34+细胞数及患者个体情况选择脐血，经锁骨下中心静脉或骨髓腔注入治疗。 脐血总有核细胞数中位值为4.11（1.94～16.25）×10／kg，其中CD34+细胞中位值为2.69（0.68～29.26）×10／kg。33 例患者中，单份脐血移植18 例，双份脐血移植15 例。 单份脐血的总有核细胞数中位值为4.31 （2.39～16.23）×10／kg； 总CD34+细 胞 数 中 位 值 为2.88（0.67～29.27）×10／kg。 双份脐血的总有核细胞数中位值为4.45（2.74～7.68）×10／kg ；总CD34+细胞数中位值为2.65（0.74～9.48）×10／kg。

对照组患者接受非血缘骨髓造血干细胞移植治疗。 供者注射重组人粒细胞 集落刺激因子5 μg（kg·d），使用时间为5 d。 第4 d 进行骨髓采集，有核细胞数要求达4×108/kg， 并回输循环采集自体血。2 d 后，采集外周血干细胞，总量10L，总单个核细胞数达4×108/kg。 采用流式细胞仪（常州必达科生物科技有限公司） 计数采集物中CD3+、CD4+、CD8+、CD34+细胞。 采集物均即刻进行患者回输。

1.3 观察指标

1.3.1 两组患者的临床疗效比较 患者的临床疗效评定参照《血液病诊断及疗效标准》[9]判断临床疗效。患者3 个月内不需输血，1 年内未复发，贫血和出血情况基本恢复正常，男性患者血红蛋白达120 g/L、女性患者血红蛋白达110 g /L；患者白细胞水平达4×109/L，血小板水平达100×109/L 为痊愈。 患者贫血和出血症状基本消失， 男性患者血红蛋白水平达120 g/L， 女性患者血红蛋白水平达100 g/L，白细胞水平达3.5×109/L，血小板有所增加，3 个月内病情较稳定，不需输血，无恶化趋势为显效。患者贫血和出血症状明显好转，不需输血，血红蛋白三个月内水平较治疗前常见值改善保持30 g/L以上为有效。 患者治疗后，各项临床症状以及血红蛋白水平、 血小板水平等均无改善甚至恶化为无效。

1.3.2 两组患者外周血Treg、Th17 细胞情况比较取患者治疗前后空腹静脉外周血5 mL， 加入红细胞裂解液1 mL，利用流式染色缓冲液清洗1 次；预冷70%乙醇固定，4 ℃条件下避光60 min，PBS 清洗2 次；加入荧光标记抗体，在4℃条件下，孵育30 min 后， 以流式染色缓冲液清洗2 次。 每管获取30000 个细胞，利用流式细胞仪（常州必达科生物科技有限公司） 测定Th17、Treg 并对Treg/Th17 进行计算。

1.3.3 血清细胞因子水平 取患者治疗前后空腹静脉血5 mL，静置30 min，3 000 r/min 离心，分离血清，利用酶联免疫试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司）测定TGF-α、INF-α，G-CSF，严格按照说明书进行操作。

1.3.4 两组患者并发症发生情况 治疗后1 年内，对患者进行随访调查，记录两组患者治疗后感染、出血、头晕、排异反应等并发症发生情况。 观察组和对照组各有两名患者随访失败。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析， 满足正态分布且方差齐的计量资料采用（±s）表示，采用两样本独立t 检验比较组间差异，计数资料用率%表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床疗效比较 观察组治疗的有效率为90.91%，与对照组的有效率（83.78%）无明显差异（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者的临床疗效比较（n，%）

2.2 两组患者外周血Treg、Th17 细胞情况比较 治疗后，两组患者外周血Treg、Treg/Th17 水平较治疗前明显上升，Th17 水平明显下降（P＜0.05），且观察组患者外周血Treg、Treg/Th17 水平明显高于对照组，Th17 水平明显低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者外周血Treg、Th17 细胞情况比较（±s）

表2 两组患者外周血Treg、Th17 细胞情况比较（±s）

注：与治疗前相比，*P＜0.05。

组别 n Treg（%）治疗前 治疗后Th17（%）治疗前 治疗后Treg/Th17治疗前 治疗后对照组观察组t P 37 33 2.20±1.35 2.45±1.58 0.731 0.466 2.91±1.61*3.83±1.87*2.211 0.030 3.48±1.48 3.36±1.52 0.334 0.739 2.73±1.05*2.08±0.83*2.849 0.005 0.59±0.13 0.54±0.17 1.390 0.168 1.01±0.75*1.94±1.07*4.246＜0.001

2.3 两组患者血清细胞因子水平比较 治疗后，两组患者TGF-α、INF-α 水平较治疗前明显下降，GCSF 水平明显上升（P＜0.05），且观察组患者TGFα、INF-α 水平明显低于对照组，G-CSF 水平明显高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 两组患者两组患者血清细胞因子水平比较（±s）

表3 两组患者两组患者血清细胞因子水平比较（±s）

注：与治疗前相比，*P＜0.05。

组别 n TGF-α（μg/L）治疗前 治疗后G-CSF（pg/mL）治疗前 治疗后INF-α（pg/mL）治疗前 治疗后对照组观察组t P 37 33 24.39±3.39 25.16±3.36 0.952 0.344 20.89±2.69*16.63±2.28*7.101＜0.001 7.93±0.72 7.86±0.79 0.387 0.699 12.39±3.03*25.62±3.39*17.243＜0.001 29.63±3.36 28.89±3.30 0.927 0.356 14.36±1.45*11.75±0.63*9.560＜0.001

2.4 两组患者的并发症发生情况比较 观察组与对照组患者并发症发生情况差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 两组患者的并发症发生情况比较（n，%）

3 讨论

再生障碍性贫血发展严重可导致骨髓造血衰竭，且疾病感染发生率高，常伴随脏器出血，感染和出血已成为患者常见死因[10]。造血干细胞不仅具有极强的自我自我复制能力且几乎可以分化为所有类型的血细胞， 并经血流迁移到外周血液循环中， 因此造血干细胞移植是治疗再生障碍性贫血最有效的方法之一。 本研究结果显示，观察组治疗的有效率为90.91%，与对照组的有效率（83.78%）无明显差异。 说明两种造血干细胞移植方式治疗再生障碍性贫血均有显著效果。

本研究结果显示， 治疗后， 两组患者外周血Treg、Treg/Th17 水平较治疗前明显上升，Th17 水平明显下降，且观察组患者外周血Treg、Treg/Th17 水平明显高于对照组，Th17 水平明显低于对照组。既往研究显示， 再生障碍性贫血的发生与患者自身免疫性系统发生异常有关[11-13]。 外周血Treg 与Th17 细胞作为重要的免疫细胞， 其水平影响着再生障碍性贫血等血液病中的治疗和恢复[14]。再生障碍性贫血患者体内，Treg 细胞水平降低，会抑制免疫耐受调节功能，使效应T 细胞发生异常增殖。 再生障碍性贫血患者治疗后，体内Th17 细胞比例会明显减低，与Treg 细胞水平呈负相关[15-16]。目前，已有相关研究证实， 脐血造血干细胞移植成功率较高，移植反应弱，对免疫系统调节效果好[17]。结合本研究说明， 接受造血干细胞移植治疗可以明显改善患者外周血Treg、Th17 情况，造血干细胞移植治疗可以有效改善机体的免疫调节功能， 且脐带血造血干细胞移植治疗效果优于血缘骨髓造血干细胞移植治疗。

治疗后，两组患者TGF-α、INF-α 水平较治疗前明显下降，G-CSF 水平明显上升，且观察组患者TGF-α、INF-α 水平明显低于对照组，G-CSF 水平明显高于对照组。 既往研究显示，TGF-α 是一种多肽生长因子，可由血小板、巨噬细胞以及淋巴细胞等分泌，TGF-α 与多种癌细胞的增殖以及细胞损伤有关[18]。 IFN 是由T 淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌的免疫介导因子， 骨髓基质中的IFN-α 分泌紊乱会使造血前体细胞功能异常， 导致造血干细胞凋亡， 再生障碍性贫血与IFN-α 分泌增加息息相关[19-21]。G-GSF 是一种造血生长因子，临床常用GGSF 治疗白细胞减少以及多种骨髓造血机能障碍等，G-GSF 可以促进中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化，G-CSF 水平上升，代表造血功能有所恢复[22]。 结合本研究结果说明，造血干细胞移植治疗可以明显改善细胞损伤，恢复骨髓造血机能，明显改善再生障碍性贫血， 且且脐带血造血干细胞移植效果优于血缘骨髓造血干细胞移植治疗。 观察组与对照组患者并发症发生情况无明显差异。 说明两种造血干细胞移植方法安全性相近。

综上所述， 脐带血造血干细胞移植和骨髓造血干细胞移植治疗再生障碍性贫血均有很好的疗效， 脐带血造血干细胞移植治疗对改善Treg 细胞水平，调节免疫反应，恢复造血功能效果更显著。