不同保存方式对新鲜母乳中免疫活性因子、细菌菌落及营养成分的影响

周晓萍，刘璐，陈兵兵

（郑州大学第一附属医院产科，河南 郑州450000）

母乳是婴儿成长最安全，最完整的天然食物，含有满足婴儿成长所需的营养和抗体， 其中的免疫球蛋白有着预防和保护婴儿不被感染和一些慢性疾病的发生，还有利于婴儿肠道健康的菌群，有助于婴儿健康生长[1-2]。 但临床上由于多因素的影响，如低体重、生理性黄疸等新生儿需进行治疗而不能及时的进行哺乳， 故需保存母乳来实现母乳喂养。 低温保存是公认保存母乳的方式[3]，但对温度和容器的选择并无统一的标准， 因此本研究以母乳中的免疫球蛋白、细菌菌落水平以及营养成分为主要观察指标，比较母乳在不同温度储存条件下各成分变化情况，旨在探讨母乳最佳储存方式。

1 资料与方法

1.1 一般资料 经本研究伦理委员会审核通过，于2018 年10 月至2020 年10 月选取于我院分娩42d 后的86 例产妇， 经产妇及其家属同意后采集新鲜母乳。 纳入标准：（1）产妇身体健康且饮食良好；（2） 为足月分娩；（3） 新生儿健康且纯母乳喂养；（4）妊娠后体质指数≤28 kg/m2。 排除标准：（1）乳头或乳晕有破损；（2）有乳腺炎或有全身性感染者；（3）有服用特殊药物者。

1.2 方法 母乳采集：将乳头及乳晕进行清洁待干后，采用吸奶器进行母乳采集，约140 mL，于30 min 内进行分装，分为7 份，每份20 mL，1 份新鲜母乳放入无菌烧杯中， 其余6 份分别储放于聚乙烯储奶瓶中， 将储奶瓶分别存放至4℃、-18℃和-20℃的冰箱中（每个温度条件各2 份）。储奶瓶均经无菌消毒。1 份新鲜母乳进行即时检测。在4℃条件保存的母乳分别于存放48 h、72 h 后进行检测，在-18℃和-20℃条件保存的母乳分别于存放30 d和90 d 后检测。 母乳采集时间点均为下午14：00～15：00 左右，产妇情绪良好。

1.3 观察指标 于设定时间点检测母乳中的免疫活性因子、细菌菌落水平、菌群种类分布，营养成分。

1.3.1 免疫活性因子 采用ELISA 法 （试剂盒：武汉益普生物科技有限公司， 酶标仪： 迈瑞MR-96A。）检测母乳中的乳铁蛋白（LF）；采用荧光化学法（仪器：迈瑞全自动化学发光免疫分析仪，型号：CL-2000i）检测母乳中白介素细胞-6（IL-6），肿瘤坏死因子（TNF-α）水平。 严格按照试剂盒、仪器说明书以及操作流程进行。

1.3.2 细菌菌落 将母乳取出后在40℃温水中进行融化或复温，并摇晃均匀，后进行离心（3000 r/15 min）， 取下层沉积。 制作血平板， 进行细菌培养（35℃，24～48 h，5% CO2）。

细菌培养结束后取出血平板，制备细菌悬液，采用比浊法检测细菌菌落计数。 （仪器：法国梅里埃DENSIMAT 比浊仪，货号：99234）。 严格按照操作流程进行。

1.3.3 营养成分 采用全自动母乳分析仪（厂家：山东国康，型号：GK-9000）检测其脂肪、蛋白质、碳水化合物水平。 严格按照仪器说明书及操作流程进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析， 满足正态分布且方差齐的计量资料采用（±s）表示，组间差异采用两样本独立t 检验比较， 重复测量方差分析比较组内母乳保存不同时间点差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比较 与新鲜母乳比较，在各设定条件下的LF 水平比较无明显差异（P＞0.05），IL-6 和TNF-α 水平比较有明显差异 （P＜0.05），IL-6 水平在各设定条件下随着时间的推移逐渐下降（P＜0.05），TNF-α 水平在4℃的条件下保存72 h 下降， 在-18℃与-20℃的条件下保存90 d 均上升（P＜0.05）。 各免疫活性因子水平在-18℃与-20℃的条件下的各时间点比较均无明显差异（P＞0.05）。 见表1。

表1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比较（±s）

表1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比较（±s）

注： 与新鲜母乳比较*P＜0.05。 与-18℃保存条件下30 d 比较①P＜0.05,与-18℃保存条件下90 d 比较②P＜0.05。4℃保存条件下与新鲜母 乳 比 较，LF 水 平 （F=0.065,P=0.937），IL-6 水 平 （F=8.000,P＜0.001），TNF-α 水平 （F=3.433,P=0.034），-18℃保存条件下与新鲜母乳比较，LF 水平 （F=0.936,P=0.393），IL-6 水平 （F=13.101,P＜0.001），TNF-α 水平 （F=9.602,P＜0.001），-20℃保存条件下与新鲜母乳比较，LF 水平 （F=0.403,P=0.669），IL-6 水平 （F=11.811,P＜0.001），TNF-α 水平（F=13.376,P＜0.001）。

保存条件 时间点新鲜母乳4℃-18℃-20℃48 h 72 h 30 d 90 d 30 d 90 d LF（mg/mL） IL-6（pg/mL）3.98±1.02 4.01±0.96 4.02±0.85 4.28±1.64 4.17±1.89 4.05±1.54①4.15±1.49②9.49±5.26 7.26±3.72 7.21±3.63*6.96±2.97*6.84±2.76*7.36±2.23*①7.12±2.13*②TNF-α（pg/mL）9.54±3.52 8.84±2.41 8.43±2.34*9.86±3.14 11.54±2.96*9.96±2.87①11.87±3.02*②

2.2 不同保存方式母乳的细菌菌落计数比较 与新鲜母乳比较， 各设定条件下的细菌菌落计数比较无明显差异（P＞0.05）。 见表2。 在4℃保存72 h后发现有细菌生长，经鉴定有52 例为革兰阳性菌生长，其中金黄色葡萄球菌12 例，表皮葡萄球菌34 例，变异库克菌6 例，有34 例革兰阴性菌生长，其中阴沟肠杆菌24 例，肺炎克雷伯杆菌10 例。

表2 不同保存方式母乳的细菌菌落计数比较（×10 cfu/mL，n=86，±s）

表2 不同保存方式母乳的细菌菌落计数比较（×10 cfu/mL，n=86，±s）

注：4℃保存条件下与新鲜母乳比较 （F=2.443,P=0.089），-18℃保存条件下与新鲜母乳比较（F=1.328,P=0.267），-20℃保存条件下与新鲜母乳比较（F=1.706,P=0.184）。

保存条件新鲜母乳4℃时间点 细菌菌落计数-18℃-20℃48 h 72 h 30 d 90 d 30 d 90 d 2.15±1.23 2.19±1.65 2.65±1.97 1.96±1.45 1.82±1.31 1.87±1.13 1.85±1.21

2.3 不同保存方式母乳的营养成分比较 与新鲜母乳比较，在各设定条件下母乳中的脂肪、蛋白质以及碳水化合物水平均随着时间的推移下降 （P<0.05），各营养物质在4℃的保存条件下仅脂肪水平在72 h 后下降明显（P<0.05），其余物质水平无明显差异（P<0.05）。 在-18℃与-20℃的条件下各营养物质下降趋势明显（P<0.05）。 见表3。

表3 不同保存方式母乳的营养成分比较

3 讨论

母乳中含有丰富的营养物质， 是新生儿初期最主要的营养来源， 可为新生儿提供大量的免疫因子，提高其免疫力，预防其受到感染[4-5]。 且母乳中的蛋白质与脂肪在新生儿肠道内易被吸收和消化，有助于婴儿健康成长[6-7]。 母乳公认的保存条件为低温保存， 但对其保存的最佳温度及时间尚无统一标准。本研究就母乳保存条件进行探讨，将86例健康产妇的母乳进行不同温度、 不同时间的保存，观察其营养物质、免疫活性因子及细菌菌落的变化。 结果显示，在各设定条件下，虽然随着时间的推移和温度的下降细菌菌落计数有下降趋势，但比较无明显差异，Pandya SP 等[8]研究也提到，母乳细菌菌落在低温状态下仍具有活性， 因而低温保存母乳是有效维持其菌落活性的手段。

LF 是母乳中的重要成分之一，具有抗菌、抗氧化和调节免疫系统等功能， 是先天防御系统的主要组成成分，为新生儿胃肠道保驾护航[9]。 本研究显示，与新鲜母乳比较，在各设定条件下的LF 水平比较无明显差异，说明LF 的稳定性较好。 IL-6和TNF-α 细胞因子具有调节免疫系统的功能，属于促炎细胞因子[10]，研究显示，IL-6 水平在各设定条件下随着时间的推移逐渐下降，且在4℃的条件下保存72 h 后有显著下降趋势， 猜测其可作为检测母乳是否新鲜的指标。TNF-α 水平在4℃的条件下保存72 h 下降， 可能与母乳在此条件下的细菌繁殖，TNF-α 消耗有关。 但TNF-α 水平在-18℃与-20℃的条件下保存90 d 均上升，考虑其活性在低温环境下仍然存在。

在母乳中的营养物质以脂肪、 蛋白质以及碳水化合物为主要营养成分，本研究显示，与新鲜母乳比较，在4℃的保存条件下，仅脂肪水平在72 h后下降明显，其他营养成分水平相对较稳定，但存在细菌生长现象。 分析其原因可能是，脂肪酶在低温条件下仍存在活性， 因而脂肪分解作用仍然存在[11]，细菌生长菌落以革兰阳性菌为主，因而不建议在4℃的条件下保存超过72 h。 于-18℃与-20℃的条件下各营养成分水平有明显的下降趋势，且随着时间的推移，下降趋势明显。 可能与蛋白质与碳水化合物黏附于容器壁上有关。Orbach R 等[12]研究提到， 在不同储存温度下母乳中蛋白质与碳水化合物的组成无显著变化，本研究结论与不同。 原因可能由于Orbach R 等采用超声波进行均化，而本研究采取手动均化的原因。 从结果中可以看出碳水化合物的下降速度较缓慢， 可能与碳水化合物黏附于容器壁上的速度有关。 本文所观察的三类物质在-18℃与-20℃中的各时间点比较无明显差异， 提示在此两种温度下进行母乳保存的效果可能一致。

综上所述， 在低温环境下保存母乳对细菌菌落无影响， 对免疫活性因子和营养物质有一定的影响，结合本研究结论，建议在4℃的保存条件下保存时长不应超过72 h，在-18 ℃与-20 ℃的保存条件下保存时长不应超过90 d。 因母乳成分复杂，本研究因时间和条件上的局限，观察的指标较少，今后仍需深入进行研究。