缺血性脑卒中患者miR-146a表达及对钙调蛋白的影响

杜 丽，耿德勤

(1.徐州医科大学第一临床医学院，江苏 徐州 221000；2.徐州医科大学附属沭阳医院，江苏 沭阳 223600；3.徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221000)

脑卒中是全球中老年人群的第二大死亡原因，脑血管缺血是最常见的原因，约80%的脑卒中为缺血性脑卒中[1].脑卒中主要由大脑中动脉阻塞引起，同时钙在细胞内积累、活性氧生成等多种细胞和分子机制参与缺氧诱导的细胞损伤[2].近年来研究[3]发现：脑缺血时不同miRNA表达改变会引发缺血后的神经损伤或神经保护作用.miR-146a已被认为是肿瘤细胞增殖、分化、迁移的主要调控因子之一[4]，动物模型也中发现miR-146a能够抑制微神经侵入和氧化应激损伤来保护脑缺血组织的神经元活性[5].但关于缺血性脑卒中患者中miR-146a表达变化及可能作用机制的研究仍十分少见.因此，本研究探讨缺血性脑卒中患者miR-146a表达及对钙调蛋白的影响.

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月—2020年5月徐州医科大学附属医院收治的急性缺血性脑卒中患者110例为缺血性脑卒中组.其中，男64例，女46例；年龄54～76岁，平均(67.35±4.91)岁.另收集健康志愿者110例为对照组，其中，男61例，女49例；年龄52～75岁，平均(66.82±5.60)岁.性别、年龄在两组患者间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性.患者均自愿参与本研究，且签署知情同意书.

入选标准：缺血性脑卒中发病14 d内；美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)5～30分.

排除标准：近1个月内有脑出血病史；有造影剂过敏史；急性出血体质，INR值>1.7或血小板计数<100×109/L.

1.2 材料与主要试剂

PC12细胞(上海通派生物有限公司)；胎牛血清、DMEM细胞培养基(上海赛百慷生物技术股份有限公司)；Trizol RNA提取试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)；反转录试剂盒(广州泛思生物科技有限公司)；脂质体2000(英杰生命技术有限公司，美国)；鼠抗人Bcl-2同源拮抗蛋白/致死蛋白(Bax)单克隆抗体、鼠抗人半胱天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)单克隆抗体、兔抗人B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)单克隆抗体、鼠抗人钙调蛋白编码基因2(CALM2)单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗(北京博奥森生物技术有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 时荧光定量PCR检测血清miR-146a表达

采集缺血性脑卒中组患者和对照组受试者外周静脉血5 mL，2 000 r/min离心10 min，收集血清1 mL，-20 ℃保存待测.使用Trizol RNA提取试剂盒收集血清总RNA，分光光度计检测其OD260/OD280吸光度值；实时荧光定量PCR检测血清标本中miR-146a浓度.以cel-miR-39为内参，miR-146a上游引物5′-AAGCAATAACCGAGACTGTCGACCTC-3′，下游引物5′-TGGAGCCTATGGGACGTGACTTAGGT-3′；cel-miR-39上游引物5′-CGAAACAGCATAGGTC ACGTTCGG-3′，下游引物5′-TGGAGCCTGGGACGT GACCTAGAC-3′.PCR反应条件：95 ℃变性1 min，95 ℃ 变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环.引物设计由重庆波尔生物科技有限公司设计合成，相对定量法测定miR-146a表达水平.

1.3.2 PC12细胞培养与分组

PC12细胞接种于12孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养，通过观察发现约有90%融合时使用脂质体2000进行瞬时转染.将转染的细胞分为空白对照组(常规培养，不作任何处理)、mimics-miR-146a转染组(转染mimics-miR-146a质粒)、mimics阴性对照组(转染mimics阴性对照质粒)、inhibitor-miR-146a转染组(转染inhibitor-miR-146a质粒)、inhibitor阴性对照组(转染inhibitor阴性对照质粒).脂质体转染6 h内用DMEM培养基进行培养，之后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h，收集细胞沉淀.

1.3.3 细胞增殖和凋亡能力检测

将5组PC12细胞接种于96孔板中，密度为4 000个/孔，于37 ℃浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养72 h后每孔加入CCK-8试剂30 μL，继续培养2 h，使用全自动定量酶标仪测定450 nm波长处每孔的吸光度值.采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平，将5组细胞分别用预冷的磷酸缓冲液洗涤3次，于4 ℃浓度为70%的乙醇溶液中固定24 h.调整细胞浓度为1×106/mL，取100 μL细胞悬液，加入浓度为1 mg/mL的碘化丙啶染液1 mL，4 ℃染色30 min，上流式细胞仪检测，之后按照说明书步骤在避光环境中分别加入5 μL的膜联蛋白V、PI，室温下培养30 min，应用流式细胞仪区分凋亡细胞，计算细胞凋亡率.

1.3.4 miR-146a靶基因预测

查询PicTar、Targetscan生物信息学数据库，预测miR-146a与钙调蛋白编码基因CALM2的靶向结合位点.

1.3.5 RT-PCR检测凋亡因子及CALM2 mRNA表达

使用Trizol RNA提取试剂盒收集5组PC12细胞的总RNA，分光光度计检测其含量，应用RT-PCR检测Bax、Caspase-9、Bcl-2、CALM2 mRNA表达水平，以GAPDH为内参，Bax上游引物5′-CATCTT AGGAAACGCCAGTGTTA-3′，下游引物5′-TGCCC CTGAAGTGTAGGCTAGGT-3′；Caspase-9上游引物5′-AGAAAC ATAGCATACCGCACTCC-3′，下游引物5′-CTCATCCTCTTCCACATCCATAT A-3′；Bcl-2上游引物5′-ACCCACCATACGATTAGAGATA C-3′，下游引物5′-TG AACGAACGACCGCAGCCAG T-3′；CALM2上游引物5′-CTCTGCCGGTCTCGCGT AGGCTA-3′，下游引物5′-TCAGCCGCAGTTGCAGT AGGAAC-3′；GAPDH上游引物5′-TAATCATATGAC GTAGCAGCGGATTC-3′，下游引物5′-TACTGTGC GTTAGACGGCATAGCATA-3′.PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 变性20 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45个循环.引物设计由重庆波尔生物科技有限公司设计合成，相对定量法测定mRNA表达水平.

1.3.6 Western blot检测凋亡因子和CALM2蛋白表达

RIPA裂解液提取5组PC12细胞的蛋白，BCA法测定蛋白浓度.取20 μg蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，冰上转膜1 h，室温下封闭2 h，加入1∶500稀释的抗人Bax单克隆抗体、1∶800稀释的鼠抗人Caspase-9单克隆抗体、1∶300稀释的兔抗人Bcl-2单克隆抗体、1∶500稀释的鼠抗人CALM2单克隆抗体、1∶1 000稀释的鼠抗人GAPDH单克隆抗体，4 ℃过夜，滴加1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG；ECL显影，使用Image J软件读取各条带的灰度值.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 缺血性脑卒中组与对照组患者血清miR-146a表达水平

缺血性脑卒中组患者血清miR-146a表达水平为0.27±0.09，明显低于对照组受试者血清miR-146a表达水平1.39±0.26，差异具有统计学意义(t=18.552，P<0.001).

2.2 各组细胞增殖和凋亡水平

mimics-miR-146a转染组PC12细胞增殖能力明显高于对照组和mimics阳性对照组，PC12细胞凋亡率明显低于对照组和mimics阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；inhibitor-miR-146a转染组PC12细胞增殖能力明显低于对照组和inhibitor阴性对照组，PC12细胞凋亡率明显高于对照组和mimics阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).PC12细胞增殖能力和凋亡率在mimics阴性对照组、inhibitor阴性对照组、空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 各组细胞增殖和凋亡水平Tab.1 Cell proliferation and apoptosis levels in each group

2.3 各组促凋亡因子表达水平

mimics-miR-146a转染组Bax、Caspase-9 的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组，Bcl-2 的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；inhibitor-miR-146a转染组Bax、Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，Bcl-2 的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).Bax、Caspase-9、Bcl-2 的mRNA和蛋白表达水平在mimics阴性对照组、inhibitor阴性对照组、空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 各组促凋亡因子的mRNA和蛋白表达水平Tab.2 mRNA and protein expression levels of pro-apoptotic factors in each group

2.4 靶基因预测情况分析

使用PicTar、Targetscan生物信息学数据库综合预测miR-146a的靶基因，结果显示miR-146a与钙调蛋白编码基因CALM2存在靶向结合位点.

2.5 各组细胞中的CALM2的mRNA和蛋白表达水平

mimics-miR-146a转染组CALM2 的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组，inhibitor-miR-146a转染组CALM2的 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).CALM2的 mRNA和蛋白表达水平在mimics阴性对照组、inhibitor阴性对照组、空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表3.

表3 各组细胞中CALM2的mRNA和蛋白表达水平Tab.3 CALM2 mRNA and protein expression levels in cells of each group

1.空白对照组；2.mimics-miR-146a转染组；3.mimics阴性对照组；4.inhibitor-miR-146a转染组；5.mimics阴性对照组.图1Western blot检测各组细胞中CALM2蛋白表达情况Fig.1Expression of CALM2 protein in cells of each group detected by Western blot

3 讨 论

miRNA调控细胞增殖、分化、凋亡等过程，研究[6]发现：哺乳动物的大脑组织中存在miRNA高表达；miRNA参与神经系统的发育和病理生理过程，与内皮功能障碍、动脉斑块不稳定、脑水肿等脑卒中中间环节的发生密切相关[7].条件敲除Dicer的研究[8]证实了miRNA参与调控突触形成、细胞增殖和分化、血管形成，进而影响大脑发育.部分参与调节脑发育的miRNA在脑缺血后被激活，提示脑发育与脑损伤之间存在重叠现象[9].识别与脑卒中发生、发展相关的miRNA，探明其生理作用和调控机制，并将其整合到基因调控网络是目前研究热点之一.从RNA干扰这个表观遗传学方面探讨脑卒中后脑损伤，对探寻急性缺血性脑卒中患者脑保护治疗的靶点、改善治疗预后具有重要意义.

近年来研究[10]发现：miR-146a能够上调跨膜受体蛋白1和人类Jagged1基因表达，促进神经元的生长和分化，参与调节神经元发育.提示miR-146a可能与神经系统疾病的发生密切相关，但对缺血性脑卒中发生与发展的影响及相关机制仍未明确.本研究结果显示：缺血性脑卒中组患者血清miR-146a表达水平明显低于对照组健康志愿者，推测miR-146a可能参与介导缺血性脑卒中的发生与发展.进一步选用具有神经细胞特性的PC12细胞深入探讨miR-146a表达对缺血性脑卒中的影响[11]，结果显示：mimics-miR-146a转染后PC12细胞的增殖能力明显提升，凋亡率明显下降；inhibitor-miR-146a转染后PC12细胞增殖能力明显下降，凋亡率明显提升.提示miR-146a表达下调能够抑制PC12细胞增殖，加速细胞凋亡，导致缺血性脑卒中病情恶化.在mimics-miR-146a转染后PC12细胞中Bax、Caspase-9表达水平明显降低，Bcl-2表达水平明显升高；inhibitor-miR-146a转染后PC12细胞中Bax、Caspase-9表达水平明显升高，Bcl-2表达水平明显降低.Bax、Caspase-9是促凋亡因子，Bcl-2是抗凋亡因子，miR-146a表达下调能够通过上调促凋亡因子表达，下调抗凋亡因子表达，促进PC12细胞凋亡，进一步加重缺血性脑卒中患者的病情.

研究[12]已证实：钙超载参与脑缺血性损伤的发生，而钙离子蛋白是钙离子发挥生理功能的主要调控因子.动物实验[13]显示：脑缺血性再灌注后随着神经元细胞中钙超载程度的增加，大鼠脑组织中CaM含量和活性明显提升，缺血再灌注后的升高幅度明显高于脑缺血后.本课题组前期研究也发现：急性缺血性脑卒中患者血清钙调蛋白含量与神经功能损伤程度呈正相关.本研究使用PicTar、Targetscan生物信息学数据库综合预测miR-146a的靶基因结果显示：miR-146a与钙调蛋白编码基因CALM2存在靶向结合位点，可能存在潜在的调控关系.进一步分析显示：mimics-miR-146a转染组CALM2的mRNA和蛋白表达水平明显升高，inhibitor-miR-146a转染组明显降低.提示miR-146a对CALM2具有负向调控作用，可推测缺血性脑卒中患者脑细胞损害机制中存在miR-146a对钙调蛋白的调控作用，下调miR-146a会导致对钙调蛋白表达的抑制作用降低，造成脑组织中钙调蛋白过表达，并参与缺血性脑卒中的钙超载损害过程.