血清sICAM1、TNFR1、miRNA155检测对早期1型糖尿病肾病诊断的价值研究*

熊 敏，潘勇军，苗新宇

(南方科技大学医院重症医学科，广东 深圳 518000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是临床常见代谢性疾病，主要表现为高血糖，其中1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)患者约占DM总人数5%～10%，是青少年常见内分泌疾病之一，近年来调查显示，成人T1DM患者人数甚至更多，全球发病率呈上升趋势[1]。糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是DM常见并发症，以尿中出现白蛋白为主要特征，DM中有20%～40%患者发展为DKD，是DM预后不良的重要原因之一[2]。DKD已逐渐成为终末期肾病(end-stage renel disease，ESRD)最主要原发病，导致肾功能发生不可逆损伤，严重危害患者生命健康。DKD早期起病隐匿，而肾穿刺活检属有创检查，患者难以接受，因此，通过血清相关指标进行早期诊断，并采取积极措施进行干预，有助于延缓疾病进展，改善患者预后。可溶性细胞间黏附因子1(soluble intercellular adhesion molecule 1，sICAM1)参与炎症反应及免疫调节，与DKD发生发展关系密切[3]。肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)家族成员，肾组织受刺激后可大量表达，对判断肾损伤具有潜在价值[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)-155参与调控炎症反应，在急性肾损伤及梗阻性肾病中表达上调，与肾损伤有关[5-6]。目前关于DKD早期诊断相关研究多集中于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，而对T1DM患者研究较少。本研究通过检测T1MD患者血清sICAM1、TNFR1、miRNA155水平，探讨三者检测对DKD早期诊断的意义，以期为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 纳入及排除标准

纳入标准：①符合世界卫生组织关于DM诊断标准[7]；②根据发病年龄、胰岛素水平等诊断为T1DM。排除标准：①T2DM或其他继发性DM患者；②急慢性感染患者；③存在心、肺、肝等器官严重损伤；④合并其他肾脏疾病；⑤合并血液系统疾病患者；⑥严重精神疾病患者；⑦合并恶性肿瘤及其他可能影响糖代谢疾病患者；⑧妊娠及哺乳期妇女；⑨使用肾毒性或影响肝肾代谢药物；⑩合并甲状腺机能减退/亢进等内分泌疾病。患者均知情同意，研究经院伦理委员会批准。

以尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)为早期DKD诊断指标[8]，收集患者24h尿液，测定UAER，根据UAER水平进行分组，UAER<20μg/min为DM组，UAER 20～200μg/min为早期DKD组。

1.2 一般资料

选取2019年1月至2021年3月我院内分泌科、肾内科收治的T1DM患者101例，其中男58例，女43例，年龄21～51岁，平均(31.79±5.48)岁。

1.3 方法

1.3.1 临床资料调查

收集患者年龄、性别、病程、吸烟史、饮酒史、治疗史(降糖、降压、降脂)等基本资料，计算身体质量指数(body mass index，BMI)，入院后禁食12h，采集清晨空腹静脉血，测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、糖化血红蛋白A1c(glycated hemoglobin A1c，HbA1c)，收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)、24h尿蛋白等临床指标。

1.3.2 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155水平检测

所有患者抽取清晨空腹静脉血5mL，3 000r/min 4℃条件下离心5min，留取上清，-80℃保存。取血清样品，sICAM1、TNFR1采用酶联免疫吸附法，根据试剂盒(上海润裕生物科技有限公司)说明书，使用680全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)在450nm处读取吸光度(A)值，以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制标准曲线，计算待测样本中sICAM1、TNFR1水平。

miRNA155采用qRT-PCR法检测，取血清样品，加入TRzol试剂，提取总RNA，检测总RNA纯度和浓度，选择A260/A280为1.8～2.0的RNA样品，使用逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)将总RNA逆转录为cDNA，配制反应体系，包括：2μL cDNA，1μL上下游引物，10μL SYBR Green Master Mix，ddH2O补充至总体积25μL。使用CFX96 PCR仪(美国Bio-Rad公司)检测血清样本中miRNA155表达水平。扩增条件：95℃预变性10min，95℃ 20s，55℃ 10s，72℃ 30s，40个循环。以U6为内参，miRNA155相对表达水平采用2-△△CT法计算。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 miRNA155引物序列

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 可能导致DKD的影响因素分析

101例T1DM患者发生DKD 37例，发生率为36.63%。两组患者年龄、性别构成比、病程、BMI、FBG、HbA1c、SBP、DBP、UA、TC、HDL、TG、LDL、吸烟、饮酒、ALT、AST、降糖治疗、降压治疗、降脂治疗构成比及FLNS、24h尿蛋白等临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。早期DKD组Scr、BUN、hs-CRP、sICAM1、TNFR1、miRNA155高于DM组，eGFR低于DM组(P<0.05)。见表2。

表2 影响T1DM患者发生DKD的单因素分析

2.2 Logistic回归分析

以T1DM患者发生DKD的影响因素为自变量(X)，以是否发生DKD为因变量(Y)，分别进行赋值，赋值方法见表3。

表3 变量赋值方法

将X和Y纳入Logistic回归模型，进行多因素分析。结果显示，hsCRP(OR=2.140，P=0.023)、eGFR(OR=0.425，P=0.009)、sICAM1(OR=4.187，P=0.001)、TNFR1(OR=4.697，P<0.001)、miRNA155(OR=3.832，P<0.001)均是导致T1DM患者发生DKD的影响因素。见表4。

表4 T1DM患者发生DKD的Logistic回归分析

2.3 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155对早期DKD的诊断价值

ROC结果显示，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155用于诊断早期DKD的最佳截断点分别为303.16ng/mL、873.21pg/mL、4.65，单独及联合诊断早期DKD的AUC分别为0.762、0.749、0.756、0.835。见表5、图1。

表5 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155对早期DKD的诊断价值

图1 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155对早期DKD的诊断价值

3 讨 论

T1DM是一种代谢紊乱综合征，与遗传、免疫功能、环境因素等有关，长期血糖控制不佳，患者处于高血糖状态，导致脂肪和蛋白质代谢紊乱，增加肾脏负担，促进肾小球肥大和硬化，引起肾功能下降，血流动力学发生改变，最终发展为DKD[9-10]。DKD早期病理改变为可逆性，及时治疗可延缓病情进展，甚至能够逆转损伤，一旦进入终末期，肾实质性损害将无逆转可能。临床上常用微量白蛋白尿及肾功能指标诊断DKD早期病变，但早期UAER受饮食、血糖及运动等因素影响较大，且部分患者肾功能出现明显下降，而微量白蛋白仍在正常范围，Scr及BUN等指标很难反应早期肾脏病变，因此，需寻找更为敏感的早期诊断指标。

炎症反应在DKD发病机制中发挥重要作用，由代谢过剩引发的慢性低度炎症状态，是导致DM并发症发生的主要机制之一，体外实验及动物实验均表明，慢性低度炎症状态与DKD发生、发展密切相关[11-12]。sICAM1是一种免疫球蛋白，广泛分布于单核细胞、内皮细胞等内，通过与受体结合形成复合物，释放各种物质，在细胞与细胞以及细胞外基质之间产生黏附作用，促进血管增生，引发DKD、糖尿病视网膜病变等DM并发症[13]。TNF-α是主要促炎因子，通过受体TNFR1、TNFR2介导炎症反应，对DKD的发生发挥病因学作用。TNFR1在机体各种细胞广泛表达，与肾损伤关系密切，血清TNFR1浓度较高的T2DM患者发生ESRD风险明显增加[14]。miRNA155参与调节炎症反应，与DKD关系密切，Beltrami等[15]研究显示，miRNA155在DKD患者中的表达是单纯DM患者的1.8倍。本研究结果显示，DKD组患者血清sICAM1、TNFR1、miRNA155较DM组明显升高，提示sICAM1、TNFR1、miRNA155均与T1DM患者肾损伤有关。另外，本研究结果还显示，DKD组hs-CRP水平升高，eGFR降低，提示hs-CRP、eGFR也是影响T1DM患者发生DKD的因素。hs-CRP是临床炎症标志物，其水平升高表明患者存在炎症反应，且在肾损伤早期已发生异常表达。部分DM患者微量尿白蛋白处于正常范围时，eGFR已发生明显下降，eGFR下降可反应肾功能损伤程度和DKD进展程度。本研究经Logistic回归分析，结果显示sICAM1、TNFR1、miRNA155、hs-CRP、eGFR均为DKD的影响因素，参与DKD发生发展过程。

本研究ROC结果显示，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155预测DKD的最佳截断点分别为：303.16ng/mL、873.21pg/mL、4.65，三者单独及联合检测用于诊断早期DKD的AUC分别为：0.762、0.749、0.756、0.835，提示三者均对DKD发生具有较高预测价值，且三者联合检测价值更高。sICAM1参与内皮细胞及炎性细胞黏附作用，主要与肾小球血管内皮细胞炎症反应有关，可反应炎症情况和功能障碍，在多种炎症性疾病中表达异常[16]。TNFR1参与TNF-α介导的炎症反应，在T1DM患者早期损伤中，TNFR1与肾小球滤过率呈负相关，对早期肾损伤具有良好预测作用[17]。miRNA155参与肾间质纤维化过程，在肥胖相关性肾病及急性肾损伤等多种肾功能障碍疾病中表达异常[18]。血清sICAM1、TNFR1、miRNA155均可在一定程度上反应肾功能损伤程度，但存在特异性不足等局限性，本研究将3种指标联合检测后AUC可达0.835，因此，临床对T1DM患者进行血清sICAM1、TNFR1、miRNA155检测，有助于早期诊断DKD，及早采取干预措施，延缓疾病进展，改善预后。

综上所述，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155均是T1DM患者发生DKD的影响因素，采用三者联合检测对DKD早期诊断价值更高，有望成为临床早期诊断DKD的可靠指标。另外，本研究尚存在研究时间相对较短及样本量较小等不足，今后仍需扩大样本量，进一步验证结论可信度。