ZNF750在结直肠癌细胞增殖中的作用和分子机制研究*

司马学琴，孙元鹏

(湖北科技学院医学部基础医学院，湖北 咸宁 437100)

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重影响患者的健康。在世界范围内，中国虽然处于结直肠癌的低发区，但是，近年来随着饮食结构及生活方式的改变，结直肠癌发病率呈逐年上升的趋势[1]。

结直肠癌的发生、发展是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂而连锁的过程，涉及多个分子的相互作用以及不同基因在DNA和RNA水平上一过性或永久性的变化[2]。

锌指蛋白750(zinc finger protein 750，ZNF750)是锌指蛋白C2H2样锌指蛋白亚群的一员，其编码基因位于染色体17q25.3，编码蛋白质长度为723个氨基酸，其中5-58位氨基酸为C2H2样结构域，可结合特异性DNA位点CCNNAGGC，702-723位氨基酸为其核定位信号，这两个结构域是其发挥转录调控功能所必需的[3]。目前，对ZNF750基因的功能和机制研究较少，ZNF750在结直肠癌发生、发展及转移中的作用及分子机制亦尚未明确。因此，本研究重点探讨ZNF750基因在结直肠癌增殖中的可能作用及分子机制，旨在阐明ZNF750在结直肠癌发生发展中的主要生物学功能，为结直肠癌的早期诊断、干预和治疗及预后奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人结直肠癌细胞株SW620和LoVo购于中国科学院细胞典藏培养中心，ZNF750小分子干扰RNA由吉玛基因公司合成。Gibco胎牛血清、1640培养基、Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬时转染试剂盒、cDNA逆转录试剂盒(MBI Fermentas公司)、荧光定量(qRT-PCR)试剂盒(MBI Fermentas公司)和碧云天MTT检测试剂盒购于广州威佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结直肠癌细胞株SW620、LoVo在1640培养基中辅以5%胎牛血清培养，置于细胞培养箱内。

1.2.2 细胞转染

选取对数生长期的SW620和LoVo细胞，按照说明书，用Lipofectamine2000试剂、ZNF750 siRNA和Negative control转染，分为ZNF750-SW620敲低组和NC-SW620对照组，ZNF750-LoVo敲低组和NC-LoVo对照组。

1.2.3 干扰RNA和引物的设计

见表1、表2。

表1 干扰RNA和阴性对照序列

表2 所选基因引物序列

1.2.4 实验组和对照组细胞的RNA提取和逆转录反应

转染48h后，选取生长良好的SW620和LoVo实验组和对照组细胞，倒掉培养基后，用PBS缓冲液冲洗2次，加入1mL Trizol试剂，把裂解物移入DEPC处理过的1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，翻转离心管，充分混合，在冰上静置10min后，在高速离心机中，4℃ 12 000rpm离心15min，把上层液体析出至另一干净离心管中，加入0.2mL异丙醇，将新的离心管在高速离心机4℃ 12 000rpm离心10min后，析出上清液，把管底的白色沉淀用DEPC水配置的75%乙醇和100%乙醇各洗涤1次，室温自然干燥后，加入20μL DEPC水溶解，用分光光度计测量提取的RNA纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明进行操作，1μg的总RNA加入逆转录试剂盒中的相应试剂，混匀后在PCR扩增仪中42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 5min后取出，置于-20℃冷冻保存。

1.2.5 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ZNF750 siRNA干扰效率

按照荧光定量试剂盒说明书，把反转录合成的cDNA，分别按剂量加入SYBR Green染料和ZNF750上下游引物(表2)，以及SYBR Green染料和内参GAPDH上下游引物(表2)，匀速离心混合后，置于ABI7 000PCR仪器中分别扩增基因ZNF750和内参基因GAPDH，用采集到的荧光定量值(Ct值)进行相对定量分析，检测SW620和LoVo细胞实验组和对照组中ZNF750的相对表达量，基因相对表达量采用2-ΔΔCt值表示，每组数值需要测定3个复孔，检测siRNA对ZNF750的干扰效率。

1.2.6 MTT检测细胞增殖活性

选取处于对数生长期的细胞，PBS缓冲液冲洗2遍后，加入胰蛋白酶液消化，使细胞充分解离，把ZNF750敲低的SW620和LoVo细胞和对照组细胞大约以每孔1 000个/细胞的密度分别接种于96孔板中，每组设置3个复孔，加入培养基，置于37℃、5% CO2培养箱内培养。24、48、72h后取出，然后向每孔内加入配置好的20μL MTT溶液，在培养箱中继续孵育4h，取出后再用PBS缓冲液冲洗，最后加入20μL的DMSO溶液，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值(OD值)。

1.2.7 平板克隆形成实验

选取处于对数期增长的细胞，PBS缓冲液冲洗，用胰蛋白酶液消化，使细胞充分分散，接种200个细胞到6孔板中，每种细胞接种3孔，然后轻轻晃动培养板，使细胞均匀平铺在培养板中，在细胞培养箱中孵育2周。当培养板中的细胞出现肉眼可见的细胞克隆时，停止培养，倒掉培养基，用缓冲液PBS轻轻冲洗3次，在空气中干燥后，再倒入1mL甲醇固定15min，然后又置于空气中干燥，待干燥完全后，用Giemsa染液染色15min，最后用蒸馏水缓缓洗净残留染液，干燥后在光镜下计算克隆数。

1.2.8 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测实验组和对照组细胞KLF4的表达

采用荧光定量PCR分别测定ZNF750-SW620敲低组和NC-SW620对照组，ZNF750-LoVo敲低组和NC-LoVo对照组，KLF4基因和内参基因GAPDH的荧光定量值(Ct值)，检测SW620和LoVo细胞实验组和对照组中KLF4的相对表达量，基因相对表达量采用2-ΔΔCt值表示，每组数值需要测定3个复孔，分析ZNF750沉默后，KLF4表达是否会有差异。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 荧光定量PCR检测ZNF750siRNA干扰效率

荧光定量PCR结果显示：瞬时转染ZNF750 siRNA后，ZNF750-SW620敲低组和NC-SW620对照组相比，ZNF750的mRNA表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；瞬时转染ZNF750 siRNA后，ZNF750-LoVo敲低组和NC-LoVo对照组相比，ZNF750的mRNA表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；说明SW620和LoVo细胞ZNF750基因敲低成功，可以进一步开展后续实验，详见表3。

表3 ZNF750 siRNA转染结直肠癌细胞株ZNF750mRNA的相对表达量

2.2 ZNF750沉默对结直肠癌细胞株SW620和LoVo增殖能力的影响

运用MTT法检测ZNF750沉默后，结直肠癌细胞SW620和LoVo增殖能力的变化。选取ZNF750敲低成功的SW620和LoVo细胞继续培养，MTT检测24、48和72h的OD值发现，实验组较对照组细胞增殖活性明显增强，差异具有显著性(P<0.01)，结果见表4和表5。表明敲低ZNF750的表达会增强结直肠癌细胞的体外增殖能力。

表4 ZNF750敲低对SW620细胞增殖活性的影响

表5 ZNF750敲低对LoVo细胞增殖活性的影响

2.3 ZNF750沉默对结直肠癌细胞株SW620和LoVo平板克隆形成能力的影响

平板克隆形成实验结果显示：ZNF750-SW620敲低组单个细胞增殖能力高于NC-SW620对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，结果见图2；ZNF750-LoVo敲低组单个细胞增殖能力也高于NC-LoVo对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，结果见图3。

与对照组相比，**P<0.01

与对照组相比，**P<0.01

2.4 ZNF750沉默后对结直肠癌细胞KLF4基因表达水平的影响

荧光定量PCR结果显示：结直肠癌细胞SW620中ZNF750敲低成功后，KLF4的mRNA表达水平较对照组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表6；结直肠癌细胞LoVo中ZNF750敲低成功后，KLF4的mRNA表达水平也较对照组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表6。表明在结直肠癌细胞中，ZNF750的沉默会使KLF4的mRNA表达水平相应下降，ZNF750可能间接调控KLF4的表达。

表6 ZNF750 siRNA转染结直肠癌细胞株KLF4 mRNA的相对表达量

3 讨 论

ZNF750在大部分上皮组织如胎盘、胸腺、肺、前列腺、皮肤、角质形成细胞中有表达，在间质细胞如外周血白细胞、T细胞、成纤维细胞中没有表达，说明ZNF750可能是上皮组织特异性表达的基因[4]。有研究[5]表明ZNF750在原发性食管癌中发挥肿瘤抑制基因的作用，ZNF750基因的突变与失活导致食管鳞癌的发生和转移，ZNF750低表达与喉鳞状细胞癌TNM分期、淋巴结转移及预后有关。也有文献[6-7]报道ZNF750基因在结直肠癌组织中的表达水平明显低于周围正常组织，而且ZNF750低表达和不良预后相关。基于以上研究报道，我们运用小分子RNA沉默ZNF750在结直肠癌细胞中的表达，进一步探讨ZNF750对结直肠癌增殖过程的影响，以及其是否调控核转录因子KLF4的表达参与结直肠癌的发生发展。

通过本实验我们发现ZNF750对结直肠癌的增殖能力有显著抑制作用，而且还参与调控KLF4的表达。有研究[8]表明，ZNF750在口腔鳞状细胞癌中通过调控KLF4基因转录参与口腔鳞癌的发生发展。这一研究结果与我们在结直肠癌的初步实验相佐证，后续我们将运用Oncomine数据库做生物信息学研究，进一步研究ZNF750通过哪种信号通路如何调控KLF4在结直肠癌中的表达，探索ZNF750在结直肠癌发生发展中的机制。