二苯乙烯苷对糖尿病小鼠认知障碍的影响*

杨 可，苏红霞，何泓一，李炎坤**

(1.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院药学院鄂南特色中药湖北省工程研究中心)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌疾病，其临床综合征表现为环境因素和遗传共同引起的糖代谢紊乱，以2型糖尿病(T2DM)最为常见。糖尿病已经成为世界性公共卫生问题并严重威胁人类健康安全，调查显示，全世界糖尿病患者已接近4.15亿，并且可能在2040年达6.42亿[1]。虽然糖尿病有许多潜在的并发症，但认知功能障碍被认为是临床上重要的并发症[2]。认知功能障碍指由多种因素共同作用导致的以认知功能受损为主的神经功能减退性疾病，认知减退涉及几个认知领域的表现下降，如言语和非言语记忆、即时和延迟记忆、执行功能、精神运动表现和信息处理速度、视觉空间、语义知识和语言能力、注意力[3]。

二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene glycoside，TSG)是何首乌中的天然活性成分。在中国被广泛用作补充精血和延长寿命的草药，在各种疾病中发挥有效的治疗作用，特别是与衰老有关的疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化、动物模型中的骨质疏松症[4]，TSG在治疗氧化剂应激损伤、癌症和糖尿病并发症的广泛生物活性中发挥关键作用[5]。但TSG对糖尿病认知障碍是否具有改善作用未见报道。本研究以小鼠腹腔注射STZ诱导DM模型，探讨TSG对糖尿病小鼠认知障碍和氧化应激损伤的改善作用，为TSG的开发利用和DM认知障碍的防治提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量20～25g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号:SCXK(鄂)2020-0018。确保饲养房温度22℃～26℃，相对湿度(40±5)%，通风，光照昼夜交替，标准动物饲料和饮用水喂养，自由摄食和饮水。

1.1.2 药品与试剂

TSG(82373-94-2)购于上海麦克林生化科技有限公司；STZ(S0130)购自Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD：A001-3-2)、丙二醛(MDA：A003-1-2)、还原型谷胱甘肽(GSH：A006-2-1)和谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX：A005-1-2)等测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 实验设备与仪器

Morris水迷宫检测装置(成都泰盟软件有限公司)，多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立及分组

参照文献[6-7]方法，C57BL/6J小鼠高脂饲料喂养4周后，用0.4% STZ溶液(40mg/kg)连续腹腔注射5d，分别在STZ 注射后第3d和7d进行尾静脉采血测定随机血糖，≥16.7mmol/L则视为DM造模成功[8]。将造模成功的DM小鼠随机分为糖尿病模型(DM)组、TSG 40mg/kg组、TSG 80mg/kg组，每组10只(DM组剔除一只死亡小鼠)；取正常饲料喂养的C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组(Con组)。

1.2.2 动物给药方法

参照本课题组成员前期研究报道[9]，TSG 40mg/kg组和TSG 80mg/kg组分别灌胃TSG 40mg/kg和80mg/kg，1次/d，连续8周；正常对照组和模型组给予等体积的生理盐水。

1.2.3 Morris水迷宫实验

各组小鼠于给药8周后利用Morris水迷宫试验检测小鼠认知功能，记录各组小鼠定位航行实验中90s内的逃避潜伏期时间及运动轨迹，以及小鼠空间探索实验中90s内在目标象限的探索时间。

1.2.4 主要生化指标的测定

水迷宫实验测试结束后，小鼠眼球取血，于低温离心(1 000r/min)15min，取上清液备用。小鼠处死后迅速取出脑组织，分离海马，制成浓度为10%的组织匀浆液，低温离心(3 000r/min)10min，收集上清液备用。依照试剂测试盒说明书，测定小鼠血浆和海马组织中SOD、GSH-Px活性以及MDA、GSH含量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 TSG对糖尿病小鼠认知行为的影响

Morris水迷宫实验结果显示，在定位航行试验中，DM组小鼠运动轨迹明显长于Con组，而TSG各剂量组小鼠运动轨迹均明显短于DM组，见图1；DM组小鼠逃避潜伏期明显长于Con组(P<0.01)，而TSG各剂量组小鼠潜伏期明显短于DM组(P<0.05)，见图2。在空间探索试验中，DM组小鼠在目标象限滞留时间百分比明显短于Con组(P<0.01)，而TSG各剂量组小鼠目标象限滞留时间百分比明显长于DM组(P<0.01)，见图3。

图1 Morris 水迷宫实验中小鼠运动轨迹

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，##P<0.01

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，##P<0.01

2.2 TSG对小鼠海马组织SOD、GSH-PX活性和MDA、GSH含量的影响

如表1所示，与Con组相比，DM组小鼠海马组织中SOD和GSH-PX活性显著降低，MDA含量显著增多，GSH含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。与DM组相比，TSG各剂量组小鼠海马中SOD、GSH-PX活性明显增加，MDA含量明显降低，GSH含量明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.01)。

表1 各组小鼠海马SOD、GSH-PX活性和MDA、GSH含量变化

2.3 TSG对小鼠血浆SOD、GSH-PX活性和MDA、GSH含量的影响

如表2所示，与Con组相比，DM组小鼠血浆中的SOD和GSH-PX活性均显著降低，MDA含量显著增多，而GSH含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。与DM组相比，TSG各剂量组小鼠血浆中的SOD和GSH-PX活性明显增加，MDA含量明显降低， GSH含量明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.01)。

表2 各组小鼠血浆SOD、GSH-PX活性和MDA、GSH含量变化

3 讨 论

随着世界人口和预期寿命的快速增加，糖尿病型的患病率将持续攀升，目前仍没有有效的药物治疗糖尿病型认知障碍，这将对人民和社会构成巨大挑战[4]。认知障碍是一种难以逆转的年龄依赖性中枢神经系统退行性疾病，由于进展缓慢，到目前为止，还没有有效的药物进行长期治疗，开发根治认知功能障碍的药物是一个待解决的难题。

中药防治中枢神经系统疾病一直是神经科学和医学领域的研究热点。中药天然产物具有疗效好、副作用少、资源丰富等先天优势。TSG是何首乌的天然植物代谢物，已被认为对神经退行性疾病有潜在的治疗作用[10]。研究表明，TSG在AD模型中有正向作用，这些作用与抗凋亡、抗氧化和其他分子机制有关大量的研究已经阐明了天然提取物在预防或延缓认知障碍过程中的优先地位[11]。

Morris水迷宫测试是为了评估空间学习和记忆而设计的，并与长时程增强LTP有关[12]。本实验以空间探索实验中的逃避潜伏期、在平台象限和跨平台的时间作为空间学习记忆的评价指标。40mg/kg和80mg/kg的TSG均能明显缩短糖尿病小鼠在定位航行实验中的逃避潜伏期(P<0.01)，延长空间探索实验中的目标象限滞留时间百分比，表明TSG能明显改善糖尿病小鼠认知功能障碍，且TSG 80mg/kg的改善作用更为明显。

氧化应激被认为是糖尿病认知障碍发病的关键因素。SOD和GSH-PX是抵御活性氧(ROS)的第一道防线，它们活性的降低导致了组织中的氧化应激[13]。MDA是体内脂质过氧化的主要产物之一，可直接损伤细胞膜[14]。GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，因而GSH水平的高低是衡量机体抗氧化能力的重要因素[15]。本实验结果显示，40mg/kg和80mg/kg的TSG均能明显提高糖尿病小鼠海马组织和血浆中的SOD和GSH-PX活性以及GSH含量，降低MDA，表明TSG能抑制糖尿病诱导的氧化损伤，且TSG 80mg/kg抑制氧化损伤作用更为明显。

综上所述，TSG可改善糖尿病小鼠认知功能障碍，其机制可能与其抑制糖尿病诱导的氧化应激损伤有关，更深入的机制还有待进一步研究。