常压室温等离子体-紫外复合诱变选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

李艳青 戴剑漉 蒋忠科 罗辉 孙承航,*

(1 广东医科大学，南方海洋科学与工程广东省实验室，湛江 524023；2 中国医学科学院&北京协和医学院 医药生物技术研究所，微生物化学研究室，北京 100050；3 中国医学科学院&北京协和医学院 医药生物技术研究所，国家卫健委抗生素生物工程重点实验室，北京 100050)

硫肽类抗生素是由微生物产生的结构复杂且含多个噻唑环的多肽类次级代谢产物。1948年发现第一个硫肽类抗生素，微球菌素(micrococcin)开始[1]，迄今已报道了上百种该类抗生素[2]。硫肽类抗生素对革兰阳性菌，尤其是对多种抗生素耐药的革兰阳性菌具有很强的抗菌活性。但由于这类抗生素普遍水溶性差、生物利用度低，仅作为动物肠道的抗菌药物，如曾经作为动物饲料添加剂的硫链丝菌素和那西肽，无法在临床使用[2-3]。目前临床抗生素耐药严重，亟需抗耐药新抗生素，如何解决水溶性差的难题，将硫肽类抗生素应用于临床，一直是学术界和制药工业界广泛关注的问题。近年来，通过化学结构修饰，已有一些硫肽类抗生素的衍生物进入了临床研究阶段，如GE2270A类似物LFF571作为治疗由艰难梭菌(Clostridioides difficile)引起的肠道感染药物，完成了临床Ⅱ期试验[4-5]。另一个GE2270A衍生物NAI003对痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)有窄谱抗菌活性，作为治疗痤疮新药也已完成临床I期研究[6]。

166A是化合物玄奘米星的代号，该化合物是由塔克拉玛干沙漠分离到的小单孢菌TMD166产生的新硫肽类抗生素，具有我国自主知识产权[7]，是目前所有已报道硫肽类抗生素分子中分子量最大的成员。硫肽类抗生素绝大多数成员没有或仅有3个及以下糖单元，而166A具有罕见的4个糖单元，天然的多糖基取代使其在改善水溶性方面具有先天的结构优势，体内外抗菌活性研究表明，它对革兰阳性菌如葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌等均有极强抑制活性，体外抗耐万古霉素肠球菌最低抑菌浓度(MIC)在0.125～0.5 μg/mL之间，体内2～4 mg/kg静脉注射即能对感染耐万古霉素肠球菌的小鼠有100%的保护作用，且体外对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)也显示出中等强度的抑制活性。因此，作为新抗感染药源分子，具有良好开发前景。为后续实验工作的需要，本研究对其产生菌TMD166进行了高产菌株选育。

紫外诱变(UV)是微生物育种中常用和有效的诱变方法之一[8-9]，由于小单孢菌细胞壁结构特殊、诱变效果欠佳且生长较缓慢[10]，仅通过UV诱变获得166A高产菌株有一定难度，而且在育种过程中，反复使用单一诱变源往往会降低突变率，产生抗性饱和和突变谱窄的现象[11]。因此，选用新诱变因子并采取多种方式可能是提高诱变效果和产量的有效途径。常压室温等离子体(ARTP)技术是近年来发展出的一种新的菌种诱变育种方法，依赖于均匀分布的高浓度活性粒子作用于微生物细胞壁或者细胞膜，增加通透性同时损伤基因，导致微生物代谢网络及生物性状发生变化[12-13]。目前，常压室温等离子体诱变已成为快速突变各类微生物基因组的有效方法。例如，该方法对一株他克莫司出发菌株进行诱变，高产菌株摇瓶发酵单位提高了162%[14]；对替考拉宁产生菌Actinoplanes teichomyceticusFIM-68的孢子进行诱变，获得一株遗传性状稳定的替考拉宁高产菌FIM-68-66，其替考拉宁产量提高了2倍[15]；通过ARTP技术对菌株米曲霉KA2308诱变处理，筛选得到米曲霉高产株菌株KA1515，曲酸产量较出发株增加31.48%[16]。新型多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system，MPMS)是以等离子体诱变为主，同时可结合紫外、化学诱变等多种手段开展复合诱变，该系统以氮气为工作气体，取代了ARTP所使用的高成本氦气，同时具有可控性强、操作简便、过程安全、获得的突变体性状稳定等特点，是一种新型微生物诱变平台。本研究以小单孢菌TMD166为出发菌株，采用MPMS复合紫外照射(MPMS-UV)，以期获得166A高产突变株，为该抗生素的进一步开发利用提供高产菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出发菌株：166A产生菌TMD166是2011年中国医学科学院医药生物技术研究所微生物化学研究室在塔克拉玛干沙漠南麓采集的沙漠植物中分离得到的一株内生放线菌，为小单孢菌属放线菌，代号TMD166。保存于中国医学科学院医药生物技术研究所微生物化学研究室。抗菌活性检定菌株：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilisCPCC 100029)。

1.1.2 培养基

(1)平板及发酵培养基(g/L)

38#培养基：葡萄糖4.0，酵母粉4.0，麦芽浸粉5.0，ZnSO4.7H2O 0.001，MnCl2.4H2O 0.001，FeSO4.7H2O 0.002，苯丙氨酸0.001，丙氨酸0.0003，维生素B10.001，维生素B20.001，维生素B60.001，烟酸0.001，生物素0.001，pH 8.5。固体培养基加琼脂12.0，115℃灭菌20 min。

(2)生物检定培养基(g/L)

牛肉膏2.5，酵母膏6.0，蛋白胨(F403) 6.0，葡萄糖2.0，琼脂13.0，pH8.0。

1.2 仪器与试剂

多功能等离子体诱变系统 (MPMS-MANDELA)：北京艾德豪克国际技术有限公司；台式振荡器(ZHWY-3212)：上海智城有限公司；高压灭菌器(SQ810C)：雅马拓科技贸易(上海)有限公司；抑菌圈测量仪(Z9)：杭州迅数科技有限公司；真空离心浓缩仪(EZ-2)：英国Genevac公司；岛津高效液相色谱仪(LC-20AT)：岛津企业管理(中国)有限公司；分析色谱柱 (4.6 mm×250 mm，粒径：5 μm)：北京绿百草科技发展有限公司。HPLC所用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 单孢子悬液制备方法

将出发菌株孢子用无菌水洗脱，置于装有玻璃珠的无菌三角瓶中，28℃，210 r/min振荡15～30 min，使孢子分散。经无菌脱脂棉过滤，制成孢子浓度约为106个/mL的单孢子悬液。

1.3.2 诱变方法

(1)紫外诱变 移取20 µL孢子悬液均匀涂抹在无菌不锈钢载片上，超净台内风干1 min形成菌膜后，转移至多功能等离子体诱变系统中进行紫外诱变。以处理时间为诱变的主要操作参数，紫外诱变条件：照射距离30 cm，波长254 nm，功率30 W，斜45度角照射。每组样品处理时间分别为15 s、30 s依次递增至120 s。处理后，用1 mL无菌水洗脱置于无菌管中，再以无菌水10倍梯度稀释，均匀涂布在平板培养基上，未经紫外线照射的菌悬液作为平行对照。以上平板28℃，避光培养7～10 d，通过菌落计数法计算诱变致死率。

(2)等离子体诱变 按照“1.3.2(1)”项下方法，不锈钢载片上取20 µL孢子悬液风干形成菌膜置于诱变系统中，以高纯(＞99.99%)氮气为工作气体，以处理时间为诱变的主要操作参数，等离子体诱变条件：垂直射频功率为100 W，处理间距5 mm，气体流量12.05 SLM(standard liters per minute)。每组样品处理时间分别为15 s、30 s依次递增至120 s，通过菌落计数法计算诱变致死率。

(3)等离子体-紫外复合诱变 按照“1.3.2(1)”和“1.3.2(2)”项下方法，不锈钢载片上取20 µL孢子悬液风干形成菌膜置于诱变系统中，选择最佳复合诱变条件连续诱变，通过菌落计数法计算诱变致死率。

1.3.3 诱变致死率及突变率的计算

诱变菌株致死率(%)=(对照平板菌落数-诱变平板菌落数)/对照平板菌落数×100%。诱变株突变率的计算以出发菌株抑菌圈直径为标准。定义抑菌圈直径大于或小于出发菌株抑菌圈直径10%以上的菌株为突变株，其中，抑菌圈直径大于出发菌株10 %的菌株定义为正突变株。因此，正突变率(%)=正突变株数/诱变菌落总数×100%。

1.3.4 菌株筛选及发酵

牛津杯固体发酵高通量初筛：挑取平板培养基上成熟单菌落至含有固体发酵培养基的牛津杯中，28℃发酵7 d，将牛津杯转移至枯草芽胞杆菌检定平板上进行166A抗菌活性检测。37℃培养12～15 h，挑取抑菌圈直径高于出发菌株的正突变菌落传代培养。

摇瓶复筛：将初筛获得的正突变株挖块接种于发酵培养基(250 mL三角瓶，装量50 mL)，在210 r/min、28℃条件下摇瓶发酵96～120 h。发酵液离心后取上清液270 µL，采用杯碟法进行生物活性检定。选取抑菌圈直径显著高于出发菌株的发酵液样品再进行HPLC分析。

1.3.5 分析方法

(1)效价测定 待检测发酵液经3000 r/min离心10 min，取25 mL上清液以等体积乙酸乙酯萃取后，取出酯相至真空离心浓缩仪中抽干。取250 µL甲醇溶解待测样品，以12000 r/min离心10 min取上清，根据文献采用的高效液相色谱法[17]，测定其中166A的含量。

(2)HPLC检测条件 色谱仪：岛津高效液相色谱仪(LC-20AT)，色谱柱：SilGreen ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)，流动相：68%甲醇-水溶液，检测波长：230 nm，流速：0.8 mL/min，进样量：15 µL。

2 结果

2.1 紫外诱变及等离子体诱变时间条件的确定

按照 “1.3.2(1)”和“1.3.2(2)”项所述紫外诱变以及等离子体诱变方法，绘制菌株诱变致死率曲线(图1～2)。结果显示，以时间为参数的诱变剂量与致死率之间存在明显的正相关性，致死率随诱变时间的延长呈上升趋势。紫外诱变中，辐射45 s时致死率达到77.44%，辐射90 s时致死率达到95.77%；等离子体诱变处理时间为30 s时，致死率为76.55%；当处理时间达到45 s，致死率为93.22%，当处理时间达到120 s时，紫外诱变和等离子体诱变致死率都接近100%。另有文献表明，紫外处理致死率在70%～80%之间时正突变率较高[18]，因此，结合致死率曲线和发酵筛选结果，在尽可能增大诱变株筛选样本量的条件下，复合诱变紫外辐射时间选择45～60 s，等离子体照射时间选择75～105 s。

图1 菌株TMD166紫外诱变致死率曲线Fig.1 The lethality rate of strain TMD166 treated by UV

图2 TMD166-UV130等离子体诱变致死率曲线Fig.2 The lethality rate of strain TMD166-UV130 treated by MPMS

2.2 等离子体-紫外复合诱变的致死率

按照“1.3.2(3)”项中等离子体-紫外复合诱变方法，将诱变株TMD166-MPMS105单孢子悬液放入诱变系统中进行复合诱变。其中，等离子体诱变处理时间为75、90和105 s；紫外线照射时间为45和60 s。涂布后，28℃培养7～10 d，统计致死率。结果显示MPMS75s-UV45s、MPMS90s-UV45s、MPMS105s-UV45s、MPMS75s-UV60s、MPMS90s-UV60s和MPMS105s-UV60s 6种条件下，菌株致死率分别为80.35%、94.35%、95.79%、86.42%、99.79%和99.88%(图3)。

图3 TMD166 MPMS-UV诱变致死率Fig.3 The lethality rate of TMD166 treated by MPMS-UV

2.3 等离子体-紫外复合诱变菌株突变率

从MPMS-UV复合诱变不同剂量组中挑取1200个单菌落，以TMD166为对照，先采用牛津杯固体发酵高通量筛选方法进行初筛，根据抑菌圈直径大于对照10%以上为正突变，计算不同MPMS-UV诱变剂量下的突变率，结果见表1。在MPMS105s-UV60s条件下诱变效果最佳，正突变率达到41.43%，显著高于其他MPMS-UV复合诱变条件。MPMS75s-UV60s诱变条件下，正突变率最低，仅为2.64%。而MPMS90s-UV60s和MPMS105s-UV60s两种诱变条件致死率接近，但正突变率差异较大，分别为12.70%和41.43%。

表1 不同复合诱变条件下的致死率和正突变率Tab 1 Lethality rate and positive mutation rate by different mutation conditions

2.4 等离子体-紫外复合诱变选育结果

以TMD166为出发菌株，按图4所示筛选流程，取在优化实验条件下，分别经UV、MPMS、MPMSUV复合诱变处理后的菌悬液涂布于分离平板上，基于牛津杯固体发酵高通量筛选方法初筛，对正突变菌株开展摇瓶复筛。所得发酵液采用杯碟法进行生物活性检测，选取抑菌圈直径显著高于出发菌株的样品进行HPLC分析，测定诱变菌株的化学效价。MPMS-UV复合诱变共挑选出400个正突变株摇瓶复筛，选取81株正突变株测定化学效价，其相对化学效价见图5。最终筛选出2株高产菌株(图6)，其中TMD166-MU1突变株的166A产量最高，经HPLC分析(图7)，相比出发菌株提高了7.47倍。

图4 诱变筛选流程图Fig.4 The flow-chart of mutagenesis and screening

图5 TMD166菌株与MPMS-UV突变株166A的相对效价Fig.5 The relative titer of 166A produced by mutants from TMD166 strain treated by MPMS-UV

图6 TMD166菌株与MPMS-UV突变株产生166A的相对化学效价Fig.6 The relative titer of 166A produced by the TMD166 and TMD166-MU1

图7 TMD166和TMD166-MU1发酵产物166A的HPLC检测图Fig.7 HPLC profiles of 166A produced from strain TMD166 and TMD166-MU1

3 结论和讨论

紫外线能使细胞DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，从而引发突变[19]。等离子体源中富含均匀分布的高浓度活性粒子，能够对微生物的遗传物质造成损伤，微生物基因序列及其代谢网络发生显著变化。本研究采用常压室温等离子体结合紫外照射的复合诱变方法，弥补了紫外单一诱变源容易产生诱变饱和效应现象的不足[20-21]，充分发挥了等离子体诱变能够提供更为丰富的突变位点以及增强遗传稳定性的优势，提高突变率的同时也增加了突变类型[22]。研究结果表明，采用常压室温等离子体-紫外复合诱变选育，结合牛津杯固体发酵高通量筛选方法，高效获得了比原始菌株166A产量提高7.47倍的复合诱变高产菌株TMD166-MU1，为166A的进一步研发利用奠定了良好基础。

除较新颖的MPMS-UV复合诱变平台外，本研究采用的牛津杯固体发酵高通量筛选方法(图8)也值得一提。由于诱变后获得的菌株数量极多，在较短时间内完成大量成熟单菌落的快速筛选难度较大。本研究采用该方法对诱变菌株开展全覆盖初筛，节省了大量的材料、时间和摇床设备，极大提高了筛选效率。结果表明，采用牛津杯固体发酵高通量筛选方法，不仅增大了筛选样本量，提高了高产菌株发现概率，还进一步体现出MPMS-UV复合诱变的核心优势，为其他次级代谢产物高产菌株的选育提供了良好的借鉴。

图8 牛津杯固体发酵高通量筛选方法Fig.8 The high throughput screening with oxford cup method