四种黏附连接功能群在睾丸中的作用回顾

沈建云，李永倩，李娇娇，聂海涛，陈德宇

（阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）

1 四种黏附连接功能群

在睾丸中，依据不同连接形态和功能，主要存在三种不同的细胞连接类型：紧密连接、锚定连接及间隙连接。其中，锚定连接又主要有四种不同连接方式,分别为：黏附连接、粘着斑、桥粒连接和半桥粒连接。这四种细胞连接的具体附着点分别为：黏附连接主要是基于细胞-细胞肌动蛋白的连接，粘着斑主要是基于细胞-基质肌动蛋白的连接，桥粒连接主要是基于细胞-细胞中间丝的连接，半桥粒连接主要是基于细胞-基质中间丝的连接。黏附连接和粘着斑的附着位点是肌动蛋白丝，桥粒连接和半桥粒连接的附着位点是中间丝。

尽管以上4种锚定连接类型彼此不同，但是都有一个主要功能，即通过细胞或细胞骨架与其他细胞或胞外基质连接形成一个网络架构，以保持组织的完整性。黏附连接作为锚定连接中重要的连接类型之一，是一种基于钙粘蛋白及肌动蛋白丝的胞间连接。它对细胞间的黏附和分选、组织形态发生和完整性非常重要。在睾丸中已经确定了四种基于肌动蛋白的细胞黏附连接功能群，它们分别为：钙粘蛋白-连环蛋白（Cadherin-Catenin）、Nectin-Afadin-Ponsin（又称NAP）、整联蛋白-层粘连蛋白(Integrin-Laminin)和Vezatin-Myosin细胞黏附群[1]，见图1。

图1 四种多蛋白复合物分子结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the molecular structure of four polyprotein complexes

这四种多蛋白复合物分别为：钙粘蛋白-连环蛋白（Cadherin-Catenin）、Nectin-Afadin-Ponsin、整合蛋白-层粘连蛋白(Integrin-Laminin)、Vezatin-MyosinVII，同时显示了能调节支持及生殖细胞动力学的信号蛋白。

2 钙粘蛋白-连环蛋白

2.1 钙粘蛋白-连环蛋白结构

钙粘蛋白是一种蛋白分子量为115-140 kDa的跨膜蛋白，属钙依赖性细胞黏附分子家族。大多数钙粘蛋白是由以下多个结构域组成的糖蛋白：两个胞质域、一个跨膜域及五个钙结合域（又称为EC1-5）。研究发现在EC1结构域内存在细胞黏附识别序列即His-Ala-Val[2]。睾丸中多种类型细胞的黏附连接都会受到His-Ala-Val合成肽或此肽抗体的影响，因此该序列在黏附连接功能的发挥中起着重要作用。

钙粘蛋白在其胞质区与连环蛋白p120ctn和β-连环蛋白结合，而β-连环蛋白又与α-连环蛋白结合，从而形成钙粘蛋白-连环蛋白复合物。γ-连环蛋白也能够结合钙粘蛋白的C端并与α-连环蛋白相互作用。

2.2 钙粘蛋白-连环蛋白功能

一般基于钙粘蛋白的黏附连接是通过钙的依赖性胞外域形成同型跨细胞相互作用，而在细胞内，连环蛋白介导钙粘蛋白的钙依赖性功能。

在睾丸中，至少有二十多种钙粘蛋白，且这些蛋白有不同的表达模式。例如，多数N-钙粘蛋白仅存在生精上皮的基底部分，N-钙粘蛋白以阶段特异性的方式与精子细胞头部相关联，表明它参与生精细胞的运动。在体外培养的生精细胞中加入一种抗N-钙粘蛋白抗体之后，其对支持细胞的黏附力增强。E-钙粘蛋白是上皮组织中主要钙粘蛋白亚型，参与细胞间接触抑制、信号传导、细胞增殖、肌动蛋白细胞骨架的重塑和细胞极性建立等[3-4]。E-钙粘蛋白还可以介导桥粒连接、紧密连接和间隙连接的组装。

有研究表明，E-钙黏蛋白和β-连环蛋白之间的初始相互作用是引发细胞黏附级联反应所必需的[5]。钙粘蛋白-连环蛋白复合物在外力的作用下能与F-肌动蛋白形成化学键，并且随着力的增加，二者的结合状态由弱迅速变为强[6]。说明钙粘蛋白-连环蛋白复合物与F-肌动蛋白的结合受到力的影响。有研究显示，钙粘蛋白-连环蛋白复合物是通过α-连环蛋白介导，从而直接地与肌动蛋白细胞骨架连接[7]，说明该连环蛋白特异性地募集并参与了黏附连接。有研究发现了一个反馈环路，通过该环路，收缩力刺激黏附连接肌动蛋白的聚合，增加E-钙粘蛋白的募集，从而增强两个连接点及其与肌动蛋白的连接[8]。此外，β-连环蛋白还能够与埃滋蛋白（Ezrin）共定位。埃滋蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白[9]。在人体内埃兹蛋白与精子获能相关[10]。

p120ctn除了诱导E-钙粘蛋白的聚集外，它在酪氨酸和丝氨酸残基上磷酸化位点的磷酸化状态变化还会影响细胞黏附性。通常磷酸化减少使得细胞黏附更紧密，而磷酸化的增加则导致黏附性丧失。说明E-钙粘蛋白和p120ctn之间的相互作用对于形成稳定的黏附连接是必需的。

GTP酶可能是钙粘蛋白和连环蛋白调控机制的一个至关重要因子。例如，通过p120ctn对Rho GTP酶的作用，发现p120ctn的过表达会增加细胞的运动能力。

研究已经显示其他蛋白质包括调节肌动蛋白聚合并直接结合纽蛋白的VASP蛋白及哺乳动物中的可直接与β-连环蛋白结合的Lin-7蛋白都定位于黏附连接处。Rho家族的几个成员如RhoA，Rac1和Cdc42也都定位于基于钙粘蛋白-连环蛋白的细胞黏附群上[11-12]。

3 Nectin-Afadin-Ponsin

3.1 Nectin-Afadin-Ponsin结构

这一蛋白群是由Nectin、Afadin和Ponsin蛋白(也称为NAP细胞黏附群)组成（图1）。NAP细胞黏附群的组装，一部分是由每个粘连蛋白家族成员介导的，这些粘连蛋白家族成员与对应细胞膜上的另一个粘连蛋白分子同型或异型交互。研究显示，Nectin-3的异型相互作用效果显示出比其同型相互作用更强[13]，例如，Nectin-3与Nectin-1的交互。

3.2 Nectin-Afadin-Ponsin功能

在睾丸中，NAP细胞黏附群与钙粘蛋白-连环蛋白系统相关联，并且这两个单元协同作用形成功能性黏附连接。

Nectin由三个域组成：单次跨膜域、与Afadin丝状肌动蛋白结合的胞浆域及三个免疫球蛋白样胞外域[14]。Nectin及类Nectin分子即Necls是免疫球蛋白超家族中不依赖钙的细胞黏附蛋白。已经鉴定4种Nectin蛋白即Nectin 1-4以及5种Necls即Necls1-5。Nectins和Necls的最大区别是与Afadin的结合能力，前者可以与Afadin结合，Nectins在细胞质区域与肌动蛋白结合蛋白AF6/Afadin结合，而后者不与Afadin结合[15-16]。有研究显示，Nectin-1，-3及Necl-5与整联蛋白αvβ3相关联[17-18]，而激活的整联蛋白αvβ3对于由Nectin介导的锚定连接组装来说是必不可少的。由此说明，Nectin及Necl与特定的锚定连接相关。研究已显示它们在细胞黏附、极化、增殖、发育等各种细胞功能中发挥重要作用[19]。研究证实，Nectin-1，-2，-3，-4在睾丸中都有表达，在支持细胞、生殖细胞和睾丸间质细胞中都发现有Nectin-2的表达，而Nectin-3仅表达于精子细胞中。在小鼠睾丸中，Nectin-2δ与F-肌动蛋白共定位于伸长的精子细胞中，这与它在顶端外质特化位点中的定位一致，表明它在精子发生过程中对生精细胞的运动有一定的作用。更重要的是，敲除Nectin-2及Nectin-3的小鼠出现不同程度的不育现象[20]。表明NAP细胞黏附单元可能是通过基于Nectin的异型相互作用，从而诱导生精上皮中细胞间的黏附，促进精子发生的完成。

Necl-2，-4，-5在睾丸中表达，尚不清楚Necl-1或Necl-3在睾丸中是否表达。其中，Necl-2在不同发育阶段的生殖细胞中强烈表达，Necl-5在生精上皮中以手指状分布。在Sertoli细胞内，它与α-微管蛋白共定位，生精细胞中的Necl-2与支持细胞中的Necl-5结合[21]。Necl-2和Necl-5的这种嗜异性相互作用可能介导支持细胞和顶端外质特化和/或支持细胞与基底位于生精上皮的早期生精细胞之间的伸长精子细胞之间的黏附。Necl-2还参与精子细胞分化过程。Necl-4在生精上皮中表现为从基底区到顶端区的手指状过程，并与4.1G蛋白共定位。其中，4.1G蛋白的敲除导致膜上Necl-4的消失并导致男性不育[22]，这表明4.1G蛋白和Necl-4的相互作用对于睾丸中细胞黏附是非常关键的。

Afadin是一种包含肌动蛋白结合域和RAS结合域的支架蛋白，它在黏附连接处与Nectin、Ponsin形成复合物。Afadin具有两种剪接变异体：l-Afadin和s-Afadin。l-Afadin是一种包含两个Ras相关结构域、PDZ结构域和三个富含脯氨酸的结构域的F-肌动蛋白结合蛋白[23]，其PDZ结构域与Nectin的胞质域结合。然而s-Afadin则缺乏F-肌动蛋白结合结构域，但其也与Nectins结合。有研究发现，s-Afadin比l-Afadin更优先结合细胞粘附分子Nectins[24]。Ensemble数据库显示，在人及小鼠中分别发现了7种和5种不同形式的l-Afadin和s-Afadin主要剪接变体[25]。由于NAP细胞黏附群需要α-连环蛋白定位到黏附连接上，而α-连环蛋白显示含有完整的l-Afadin结合位点，说明在钙粘蛋白-连环蛋白和NAP细胞黏附群之间存在交叉作用。研究表明，l-Afadin的F-肌动蛋白结合结构域是增强紧密连接和黏附连接的形成所必需的[26]。有研究显示，Afadin是形成细胞间接触过程中的钙粘蛋白动力学所必需的[27]。但是目前鲜有关于睾丸中Afadin功能的报道。

Ponsin是NAP细胞黏附群的第三个成员，是一类睾丸中的接头蛋白。其N端由一个SOHO结构域，C端存在3个串联的SH3结构域，与l-Afadin或纽蛋白相互作用形成复合物。Ponsin作为一种肌动蛋白结合蛋白，它与α-连环蛋白结合并被募集到黏附连接处[28-29]。它的募集可以增加与黏附连接相关的肌动蛋白丝数量，从而增强黏附连接的结构和功能[30]。Ponsin和α-连环蛋白是机械转导以及参与基于钙粘蛋白连接处将复合物锚定到肌动蛋白的关键分子，且纽蛋白也在细胞-基底连接处起作用[31]。以上表明，Ponsin参与钙粘蛋白-连环蛋白和NAP细胞黏附群的连接。

4 整联蛋白-层粘连蛋白

4.1 整联蛋白-层粘连蛋白结构

整联蛋白是一类将细胞骨架与细胞外基质连接起来的跨膜蛋白。层粘连蛋白是一种由α，β和γ链组成的糖蛋白，主要参与细胞黏附、生长、分化和迁移等。

4.2 整联蛋白-层粘连蛋白功能

整联蛋白与钙粘蛋白和选择蛋白的相互作用已被认为是整联蛋白参与细胞间黏附所必需的[32]。层粘连蛋白通常作为整联蛋白的配体，主要在细胞-细胞外基质界面诱导信号传导[33]。

4.3 整联蛋白-层粘连蛋白主要成员及其作用方式

层粘连蛋白是基底膜中主要的细胞粘附蛋白，由α，β和γ链组成。在人体中有5条α链，4条β链及6条γ链，它们可产生10多种组合[34-35]。基膜中的层粘连蛋白α2可介导支持细胞中F-肌动蛋白的组装，维持着血-睾屏障的完整性[36]。层粘连蛋白α2的缺乏会导致雄性小鼠不育[37]。

在成年大鼠睾丸中位于支持细胞/精子细胞连接处发现的α6β1整联蛋白的结合伴侣为含γ3链层粘连蛋白[38]。有研究显示，由于缺乏一种保守的谷氨酸残基，含有γ3链同种型的层粘连蛋白不直接与整联蛋白结合[39]。另外，在成年大鼠睾丸顶端外质特化中，含α3链层粘连蛋白及β3链层粘连蛋白也可以与α6β1整联蛋白相互作用。并且含α3，β3和γ3链层粘连蛋白仅限于正在伸长或已经伸长的精子细胞中存在[40]。有研究表明，睾丸中的支持细胞-生殖细胞黏附连接动力学至少部分是由整联蛋白-层粘连蛋白复合物利用一些蛋白激酶（如PI3K、PKB、PAK-2）作为调节蛋白并通过ERK信号传导途径来调节的[41]。

5 Vezatin-Myosin VII

5.1 Vezatin-Myosin VII结构

Vezatin是一种新型跨膜蛋白，在其长胞内域处与MyosinVIIa结合。MyosinVIIa是一种以肌动蛋白为细胞骨架的运动蛋白。其在结构上除了与Vezatin相关，还与蛋白激酶A相关。

5.2 Vezatin-Myosin VII功能

Vezatin可将MyosinVIIa或钙粘蛋白-连环蛋白复合物与肌动蛋白细胞骨架桥接。

5.3 Vezatin-Myosin VII主要成员及其作用方式

Vezatin与α-和β-连环蛋白免疫共沉淀，它可能通过与α-连环蛋白的羧基末端区域间接连接介导MyosinVIIa募集至黏附连接处。研究证实Vezatin仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达，在支持细胞外质中不表达。而在单倍体生殖细胞中，Vezatin仅存在于顶体中，在成熟的精子细胞中，Vezatin似乎既在顶体又在顶体外顶膜中[42]。

Myosin VIIa是一种250 kDa的蛋白，主要存在于各种器官如脑、肠、肝、肾和睾丸中，是一类在细胞内负责运输的分子。在睾丸中，Myosin VIIa与支持细胞-生殖细胞外质特化相关[43]，呈现高度表达状态。由于Myosin VIIa在调节肌动蛋白动力学中的固有特性，所以该蛋白可能参与了在外质特化部位肌动蛋白丝的更新。另外，Myosin VIIa在维持外质特化的细胞完整性和支持细胞功能方面起着重要作用。研究显示，敲除大鼠睾丸支持细胞中的Myosin VIIa会导致生精组织肌动蛋白细胞骨架的紊乱[44]。在Myosin VIIa缺陷的马尾附睾中注意到圆形/伸长的精子细胞的过早释放和精子中的许多缺陷，这提示在大鼠精子发生过程中细胞粘附和精子运输方面存在严重问题。Myosin VIIa的激活刺激Ponsin募集到细胞-细胞连接处并使得内皮细胞之间的黏附区增厚[45-48]。Myosin VIIa诱导的细胞粘附和迁移由整联蛋白αvβ5介导。总之，Myosin VIIa与整联蛋白β5亚基相互作用并以整联蛋白依赖性方式调节细胞黏附和运动[49]。

6 总结及展望

男性生殖健康一直是社会关注的热点，而男性避孕药的开发也是研究睾丸生理结构及其作用机制的一个具体应用。主要对睾丸锚定连接中黏附连接相关蛋白进行回顾，在基于肌动蛋白的细胞黏附连接功能群中，钙粘蛋白-连环蛋白复合物的研究一直比较多，与其相关的蛋白质结构及功能也渐清晰。而NAP复合物则在最近些年受到更多关注，Afadin蛋白在睾丸中的作用仍值得关注，Ponsin蛋白在睾丸中作用的具体机制尚待进一步研究。整联蛋白-层粘连蛋白复合物相关蛋白在其他组织中研究较多，在精子生成过程中扮演的角色研究仍待加强。Vezatin-Myosin VII复合物中的相关蛋白不仅调节细胞黏附连接还与外质特化相关[43]。多数与黏附连接相关的蛋白质研究是在体外其他上皮、组织或器官中进行的，而调控黏附连接与生殖细胞运动有关的蛋白质研究则相对滞后。近些年对黏附连接功能群相关蛋白结构和作用等有了一些新的认识，如敲低睾丸Myosin VIIA蛋白，会诱导跨生精上皮的肌动蛋白和基于微管的细胞骨架的解体[44]，但是其机制方面仍值得不断探索。