夏枯草口服液HPLC指纹图谱的建立及5种成分的含量测定*

汤蕊，高庆军，杨慧芳1,，罗雪1,，陈星宏1,，赵代伟

(1.贵州医科大学 临床医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 甲状腺外科，贵州 贵阳 550004；3.贵州省第二人民医院 普外科，贵州 贵阳 550004)

夏枯草口服液是由夏枯草单味药材经提取浓缩制成的单方制剂，收载于《中国药典》(2020年版)一部[1]，主要含有迷迭香酸、咖啡酸等有机酸类成分[2]，具有清火名目、散结消肿等功效，用于甲状腺肿大、乳腺增生等疾病[3]，其疗效确切、不良反应少[4-5]。目前，对夏枯草口服液相关研究主要集中于临床方面[6-7]，质量控制研究较少[8-9]；质量标准仅对迷迭香酸与总黄酮含量进行定量测定[1]，而中药成分复杂，简单的定量难以对其整体质量进行有效控制。指纹图谱作为一种半定量技术，为中药整体质量控制提供了切实有效的方法，已成为国际普遍接受的中药质量评价模式[10-14]。为确保夏枯草口服液质量的均一、稳定、安全，进一步加强该制剂整体质量的控制，更好地发挥其临床应用价值，本研究采用HPLC建立夏枯草口服液指纹图谱，同时测定其中的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛5种成分，以期为夏枯草口服液质量控制与评价奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1仪器 Thermo Fisher UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，配备系统控制器、脱气组件、自动进样器、柱温箱、温控样品室、四元梯度泵、Chromeleon色谱数据工作站)，Mettler AE-240型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)仪器有限公司]，KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q Integral Water Purification System 超纯水机(美国Millipore公司)。

1.1.2试药 25批次夏枯草口服液(规格：每支装10 mL，批号170404、170405、170406、170411、170412、170413、170415、170417、181103、190103、190104、190105、190109、190111、190113、190117、190202、190203、190204、190206、190207、190210、190212、190213、190218)，分别表示为S1～S25，均由贵州新天药业股份有限公司提供；迷迭香酸对照品(批号190812)、咖啡酸对照品(批号191028)、丹参素对照品(批号190721)、原儿茶酸对照品(批号191218)、原儿茶醛对照品(批号200510)，纯度均≥98%，均购于成都植标化纯生物技术有限公司，乙腈为HPLC级，甲醇、磷酸等试剂均为AR级，水为自制超纯水。

1.2 研究方法

1.2.1色谱条件 色谱柱为ACE EXCEL 5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35 min、5%～20%A，35～37 min、20%～26%A，37～56 min、26%～32%A，56～64 min、32%～38%A，64～92 min、38%～59%A，92～105 min、59%～70%A，105～110 min、70%～95%A)；进样量10 μL，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm。

1.2.2对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，加20%甲醇制成每1 mL含迷迭香酸1.180 mg、咖啡酸0.129 4 mg、丹参素1.186 mg、原儿茶酸0.150 9 mg、原儿茶醛0.206 8 mg的混合对照品溶液。

1.2.3供试品溶液的制备 取夏枯草口服液，精密量取2.0 mL，置5 mL量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.4指纹图谱的建立 (1)精密度试验：取夏枯草口服液(S9)同一供试品溶液连续进样测定6次得各色谱峰保留时间和峰面积，选取参照峰(S)计算各共有峰相对保留时间(RRT)及相对峰面积(RPA);(2)重复性试验：取夏枯草口服液(S9)平行制备6份供试品溶液进样测定得各色谱峰保留时间和峰面积，选取参照峰(S)计算各共有峰RRT及RPA;(3)稳定性试验：取夏枯草口服液(S9)同一供试品溶液室温下于0、3、6、9、12、24 h分别进样测定得各色谱峰保留时间和峰面积，选取参照峰(S)计算各共有峰RRT及RPA;(4)对照指纹图谱的建立：取各批次夏枯草口服液进样测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”建立25批次夏枯草口服液指纹图谱，并计算相似度。

1.2.5含量测定 (1)色谱条件、混合对照品溶液及供试品溶液的制备：同1.2.1、1.2.2、1.2.3项下方法;(2)线性关系考察：精密吸取迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的混合对照品溶液适量，倍比稀释配制成系列混合对照品溶液进样测定；以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准工作曲线，计算回归方程;(3)精密度试验：取夏枯草口服液(S9)同一供试品溶液连续进样测定6次得各色谱峰峰面积，计算迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的RSD;(4)重复性试验：取夏枯草口服液(S9)平行制备6份供试品溶液进样测定得各色谱峰峰面积，计算迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的含量及RSD;(5)稳定性试验：取夏枯草口服液(S9)同一供试品溶液室温下于0、3、6、9、12、24 h进样测定得各色谱峰峰面积，计算迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的RSD;(6)加样回收率试验：取已知5种成分含量的夏枯草口服液(S9)6份，每份精密量取1.0 mL，分别精密加入对照品溶液适量、制备供试品溶液，进样测定得色谱峰峰面积，计算迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的平均回收率及RSD;(7)样品测定：取夏枯草口服液样品，共25批次，每批2份，制备供试品溶液进样测定得各色谱峰峰面积，按标准曲线法分别计算25批次样品中迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛的含量。

2 结果

2.1 指纹图谱结果

2.1.1方法学考察 精密度试验、重复性试验、稳定性试验结果显示迷迭香酸等50个共有峰RRT的RSD分别≤0.446%、≤0.559%、≤0.614%，RPA的RSD分别≤2.94%、≤0.559%、≤2.81%，表明仪器精密度良好、方法重复性良好、供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.2对照指纹图谱的建立与共有峰的指认 HPLC对照指纹图谱和25批次夏枯草口服液叠加指纹图谱见图1，共标定50个共有峰。经对照品比对，并结合紫外光谱信息分析，指认出其中13号峰(丹参素)、14号峰(原儿茶酸)、16号峰(原儿茶醛)、22号峰(咖啡酸)、39号峰(迷迭香酸)，混合对照品溶液和夏枯草口服液样品(S9)HPLC图见图2。以保留时间适中、分离度较好、峰面积较大、峰形较稳定的39号峰(迷迭香酸)为参照峰(S)，计算指纹图谱中各共有峰的RRT和RPA，结果迷迭香酸等50个共有峰RRT的RSD≤0.833%，表明不同批次样品所含化学成分种类基本一致，但其RPA的RSD相差较大、表明各化学成分含量差异较大。

注：1～50为指纹图谱共有峰编号。图1 夏枯草口服液HPLC对照指纹图谱(A)和25批次样品叠加指纹图谱(B)Fig.1 HPLC controlled fingerprint (A) and superimposed fingerprint (B) of 25 batches of xiakucao oral liquid

注：13为丹参素、14为原儿茶酸、16为原儿茶醛、22为咖啡酸、39为迷迭香酸。图2 混合对照品(A)和夏枯草口服液S9(B)的HPLC图Fig.2 HPLC of mixed control (A) and xiakucao oral liquid S9 (B)

2.1.3指纹图谱相似度评价 相似度评价结果见表1。结果显示，不同批次夏枯草口服液相似度均>0.90，表明夏枯草口服液的制备工艺与整体质量较稳定。

表1 25批次夏枯草口服液指纹图谱相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation for 25 batches of xiakucao oral liquid fingerprint

2.2 指纹图谱化学模式识别

2.2.1主成分分析(PCA) 以迷迭香酸等50个共有峰的峰面积为变量，运用SIMCA 14.1软件进行主成分分析，特征值及方差贡献率见表2。前3个主成分的累积方差贡献率为97.154%，表明该3个成分能代表夏枯草口服液的基本特征和主要信息。主成分载荷图可说明原始变量与主成分的相关程度，结果显示，39号峰(迷迭香酸)、13号峰(丹参素)、45号峰、16号峰(原儿茶醛)、22号峰(咖啡酸)、50号峰、29号峰对样品的整体质量起主要影响作用。见图3。PCA散点得分图表明25批次样品主要可分为2类。见图4。

表2 3个主成分的特征值与方差贡献率Tab.2 Eigenvalues and contribution rates of 3 principal components

图3 夏枯草口服液PCA(3D)载荷图Fig.3 Loading plot (3D) in xiakucao oral liquid

图4 25批次夏枯草口服液PCA散点图Fig.4 PCA scatter diagram in 25 batches of xiakucao oral liquid

2.2.2正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) 为进一步分析不同分类样品间差异，采用有监督的OPLS-DA建模研究，OPLS-DA模型主成分回归系数Q2=0.959、模型区分参数R2Y=0.778、矩阵结实率R2X=0.658，表明模型预测能力较好。对变量重要性投影值(VIP)参数进行分析，见图5，VIP>1的色谱峰为39号峰(迷迭香酸)、50号峰、13号峰(丹参素)，表明迷迭香酸、丹参素等3种成分对样本分类贡献较大，是影响样品产生差异的主要标志物。

图5 夏枯草口服液中各成分的VIP值Fig.5 VIP values of different ingredients in xiakucao oral liquid

2.3 含量测定结果

2.3.1方法学考察 (1)线性关系考察结果见表3，5种指标成分在相应的浓度范围内线性关系良好;(2)精密度试验、重复性试验、稳定性试验测得5种指标成分峰面积的RSD见表4，其中重复性试验测得夏枯草口服液每1 mL含迷迭香酸1.729 mg、咖啡酸0.071 5 mg、丹参素1.370 mg、原儿茶酸0.056 3 mg、原儿茶醛0.083 4 mg，表明仪器精密度良好、方法重复性良好、供试品溶液在24 h内稳定性良好;(3)加样回收率结果见表5，丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸的平均加样回收率在98.44%～103.6%，RSD≤2.67%，表明方法准确度良好。

表3 夏枯草口服液5种成分相应浓度范围内的线性关系Tab.3 Linear relationship of various constituents in xiakucao oral liquid

表4 精密度试验、重复性试验、稳定性试验Tab.4 The precision,repeatability,and stability tests of various constituents

表5 夏枯草口服液5种成分相应浓度范围内的回收率试验Tab.5 The recovery tests of various constituents

2.3.2样品测定 测得样品中迷迭香酸含量均不少于0.80 g/L，表明所测多批次夏枯草口服液均符合该制剂现行质量标准[1]，但不同批次制剂间同一成分含量存在一定差异。见表6。

表6 25批夏枯草口服液中5种成分的含量(n=2)Tab.6 Contents of five constituents in 25 batches of xiakucao oral liquid(n=2)

3 讨论

夏枯草口服液由夏枯草水煎制成[1]，大极性成分较多，对样品采用直接滤过、萃取、挥干复溶等方法处理，进样分析发现样品中所含色谱峰数目均无明显变化，而其中迷迭香酸含量较高，最终确定采用20%甲醇稀释后直接滤过制备供试品溶液，结果表明按稀释的方法制备供试品溶液，无需经过复杂前处理，简单快捷，可较多的保留样品中的化学成分，且基线平稳，重复性、加样回收率试验良好。

本试验对色谱条件进行优化，考察了ACE EXCEL 5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ACE EXCEL 5 Super C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、ACE EXCEL 5 C18AR(250 mm×4.6 mm,5 μm)等色谱柱对夏枯草口服液中成分的分离情况，结果采用ACE EXCEL 5 C18色谱柱的分离效果与峰形优于其余两种；夏枯草口服液含有多种有机酸成分[2]，为抑制拖尾得到较好峰形，考察了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸4种流动相体系，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，峰形较好，基线较平稳；试验采用二极管阵列检测器DAD对样品进行紫外全波长扫描，分析发现在280 nm波长条件下，色谱峰数目较多，信息量较大，基线平稳，含量测定指标成分的分离度良好，故选择280 nm作为检测波长；试验比较了25 ℃、30 ℃、35 ℃等柱温及0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min等流速对色谱峰分离的影响，最终确定柱温为30 ℃、流速为1.0 mL/min，结果色谱峰分离良好、保留时间适中、重复性良好。在拟定的色谱条件下，各成分的峰形较好、分离度良好，基线平稳，重复性良好。

相似度评价结果表明夏枯草口服液制备工艺与整体质量较稳定，通过PCA及OPLS-DA寻找到影响样品产生差异的成分主要为39号峰(迷迭香酸)、13号峰(丹参素)、16号峰(原儿茶醛)、22号峰(咖啡酸)、50号峰等色谱峰，其中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸等是夏枯草口服液的主要活性成分，在抗肿瘤、免疫抑制等方面均表现出显著作用，对甲状腺、乳腺等癌症具有良好的治疗效果[15-20]。故而本试验选择迷迭香酸、咖啡酸、丹参素作为含量测定指标成分，并同时测定原儿茶酸和原儿茶醛的含量，进一步兼顾了微量成分与多成分融合起调节作用的传统中医药理论，丰富了夏枯草口服液的质控指标。含量测定结果显示，测定样品所含迷迭香酸的含量均符合该制剂现行质量标准，但各成分含量RSD均较大，提示在该制剂的生产中需注意原料药材的采购、质控、投料或勾兑及制备工艺的稳定性，以确保制剂质量的均一、稳定、安全、有效，更好地发挥其临床应用价值。

本研究首次建立了夏枯草口服液的HPLC指纹图谱，并同时测定其中5种成分含量，该方法简便可靠、准确易行，可为夏枯草口服液质量标准的完善和提高提供实验依据。