糖通饮含药血清对高糖培养HBZY-1细胞microRNA-21、Smad7以及α-SMA表达的影响*

伏红颖，潘艳伶，陈俞如，陈洪民

(1.贵州医科大学 临床医学院 中医学教研室，贵州 贵阳 550000；2.贵州医科大学附属医院 中医科，贵州 贵阳 550000)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的慢性并发症之一，已经成为引起终末期肾病的主要原因之一，严重威胁人类健康。肾小球系膜细胞是肾小球的固有细胞，具有收缩、吞噬、增殖、分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、产生细胞因子以及生长因子的作用，系膜细胞的增殖以及ECM的积聚是导致DKD肾纤维化的重要因素[1]。近年来研究发现，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)与肾小球系膜细胞的增殖和ECM积聚密切相关[2]；高糖状态下过表达的microRNA-21(miR-21)可促进ECM增多，加快肾纤维化进程[3]；而作为miR-21靶基因的Smad7[4]，其表达被抑制，也会促进肾纤维化的进程[5]。本课题组在前期动物及临床实验研究中发现，临床经验方糖通饮可降低早期DKD大鼠24 h尿蛋白水平，保护DKD大鼠肾组织，延缓DKD进展，且在临床使用中疗效显著[6-7]。推测糖通饮可能通过抑制miR-21和α-SMA的表达、升高Smad7表达达到抑制高糖状态下系膜细胞增殖的作用，本实验观察高糖环境下糖通饮中药血清对HBZY-1细胞增殖以及对miR-21、Smad7、α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)因子的影响，从细胞层面进一步探寻糖通饮延缓DKD进展的可能靶点，为糖通饮的临床使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及细胞 30只SPF级雄性SD大鼠，体质量(180±20) g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号SCXK(辽)2020-0001,动物实验设计严格经过贵州医科大学临床医学院伦理委员会审查(审批编号2000575)，实验动物使用许可证号SYXK(黔)2018-0001。大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1(批号HTX1809)，购自深圳Otwo Biotech公司。

1.1.2药物 糖通饮颗粒制剂，由广东一方制药有限公司提供，组成药物为生地3.6 g(相当于12 g生药饮片)、山药0.75 g(相当于15 g生药饮片)、山茱萸2.5 g(相当于10 g生药饮片)、茯苓0.75 g(相当于15 g生药饮片)、泽泻0.9 g(相当于9 g生药饮片)、丹皮2 g(相当于12 g生药饮片)、黄芪4 g(相当于20 g生药饮片)、丹参2.7 g(相当于15 g生药饮片)、地骨皮0.75 g(相当于15 g生药饮片)、草决明3 g(相当于15 g生药饮片)。一付生药138 g等于糖通饮颗粒剂20.95 g；将糖通饮颗粒剂20.95 g溶入饮用水138 mL中，生药浓度为1 g/mL。

1.1.3主要试剂 抗Smad7抗体(批号ab216428)和抗α-SMA抗体(批号ab7817)购自abcam公司，抗GAPDH 抗体(批号HRP-60004)、山羊抗兔IgG-HRP二抗(批号M21002S)购自proteintech公司，胰酶细胞消化液(批号25200-056)、DMEM培养基(批号C11885500BT，5.5 mmol/L glucose)由Gibco Introvagen公司提供，青链霉素双抗(批号SV30010)由HyClone公司提供，Opti-MEM(批号31985-070)购自Gibco公司，Lipofectamine 2000(批号11668027)购自Invitrogen公司，特级胎牛血清(南美，批号04-001-1ACS)由BI公司提供，cDNA合成试剂盒(批号K1622)购自thermo公司,PCR逆转录试剂盒(批号HB190916)、SYBR(批号HB210322)购自上海翊圣生物科技有限公司，miR-21的q-pcr试剂盒(批号C10712-1)购自锐博公司，CCK-8试剂盒(批号K1018)购自APExBIO公司。

1.1.4主要仪器 CO2培养箱(美国thermo公司)、超净工作台(苏州净化)、倒置显微镜(德国 Leica 公司)、实时荧光定量PCR仪C1000(美国 BIO-RAD 公司)、凝胶成像分析系统(上海天能科技公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 细胞鉴定后，选取第3～15代细胞在体积分数为10% FBS的DMEM培养基中(包含FBS、青链霉素和5.5 mmol/L葡萄糖DMEM)培养，待细胞融合度达80%～90%时进行传代，细胞置于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中。

1.2.2含药血清的制备 30只SPF级雄性SD大鼠，随机分为空白对照组和糖通饮组，每组15只；糖通饮生药浓度为1 g/mL，按照人体-大鼠体表面积比值换算，以12.4 g/(kg·d)灌胃给药,空白对照组给予等体积的双蒸水，两组均连续灌胃7 d；末次灌胃1 h后，分别经股动脉取血，血样静置2 h后，4 ℃，3 000 r/min离心20 min，分离血清后分装放入1.5 mL EP管，做好标记，并置于60 ℃水浴30 min，灭活补体，在超净工作台过滤除菌后，冻存于-80 ℃[8]。

1.2.3不同浓度含药血清DMEM培养基配置 以高糖+低浓度糖通饮含药血清培养基(30 mmol/L葡萄糖+体积分数5%糖通饮含药血清)50 mL的配比为例：称取 0.220 7g 的葡萄糖充分溶于 47.5 mL 的正常糖培养液中，在超净工作台用过滤器过滤后，加入2.5 mL糖通饮含药血清，颠倒混匀后分装于5 mL离心管中，充分混匀后于-20 ℃或者4 ℃储存。中、高浓度糖通饮含药血清培养基配比方法同高糖+低浓度糖通饮含药血清培养基配比，糖通饮含药血清和DMEM所取体积按对应比例。

1.2.4CCK-8法筛选最佳浓度中药血清 系膜细胞计数后，将细胞以3×104/mL 接种于96 孔板中，细胞贴壁后，用无血清正常糖DMEM培养液同步化细胞24 h，同时设立正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、高糖+低、中、高浓度糖通饮含药血清组(30 mmol/L葡萄糖)共5个组，每组6个复孔(低、中、高浓度组的中药血清浓度体积分数分别为5%、10%以及15%糖通饮大鼠血清[9])，按分组给予相应体积分数糖通饮含药血清干预。培养48 h后，每孔加入0.5%的CCK-8溶液10 μL，继续培养4 h，用酶标仪检测各孔在波长450 nm处吸光值，同时设置空白组和对照组。计算细胞增殖率，细胞增殖率=[(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)]×100%，以确定最佳浓度糖通饮含药血清，并将这一浓度用于后续实验中。

1.2.5CCK-8法检测实验各组HBZY-1细胞增殖情况 检测方法同1.2.4，筛选出最佳浓度糖通饮含药血清后，将细胞共分为正常糖+空白血清组(5.5 mmol/L葡萄糖+10%空白血清组大鼠血清)、高糖+空白血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清组大鼠血清)、高糖+最佳浓度糖通饮含药血清组[30 mmol/L葡萄糖+10%糖通饮组大鼠血清(1.2.4实验筛选出的最佳浓度血清)]，每组6个复孔。

1.2.6实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-21表达，以及Smad7、α-SMA的mRNA表达 收集培养的各组细胞，按Trizol说明书提取细胞总RNA。根据广州锐博的miRNA逆转录试剂盒和miRNA q-PCR试剂盒说明书检测miR-21的表达，以U6作为内参(miR-21和U6的引物均由广州锐博公司设计)。根据上海翊圣公司反转录试剂盒操作说明书将RNA逆转录为cDNA，按荧光定量PCR试剂盒检测Smad7、α-SMAmRNA表达，以GAPDH作为内参；引物序列Smad7为 F-5′-GAGGCTACTGTGTCCAAGA-3′、R-5′-TGTTGTCCGAATTGAGCTGTC-3′(95 bp)，α-SMA为F-5′-AGCGTGGCTATTCCTTCGT-3′、R-5′-CTCATTTTCAAAGTCCAGAGCTACA-3′(95 bp)，内参照GAPDH为F-5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′、R-5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′(92 bp)。2-ΔΔCt计算各组基因相对表达量，并进行统计分析。

1.2.7Western blot法检测各组细胞Smad7、α-SMA的蛋白表达 将培养结束的六孔板拿出，吸去培养基，用PBS洗3次，加入含PMSF的裂解液，于冰上裂解40 min后收集到标记好的EP管中，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，将上清液吸入新的EP管，按4 ∶1(裂解液 ∶5×Buffer)的比例加入5×Buffer，震荡混匀，煮沸后经过10%SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，50 g/L脱脂牛奶封闭，TBST洗膜后，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1 h，Bio-Rad凝胶成像系统曝光后，以GAPDH 为内参，对PVDF膜的显影条带进行灰度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HBZY-1细胞生长状态

大鼠HBZY-1细胞传代24 h后，即可贴壁，贴壁后经倒置显微镜观察显示，细胞呈星状或梭形，生长状态较好，可进行药物干预。见图1。

注：A为细胞贴壁24 h，B为细胞贴壁48 h。图1 HBZY-1细胞生长状态(5.5 mmol/L葡萄糖，×40)Fig.1 Growth status of HBZY-1 cells (5.5 mmol/L glucose,×40)

2.2 不同浓度中药血清组细胞增殖情况

结果显示，与正常糖组相比，高糖组细胞增殖率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与高糖组相比较，低、中、高浓度糖通饮含药血清组细胞增殖率均降低，差异有统计学意义(F=15.3，P<0.05)；中、高浓度糖通饮含药血清组间细胞增殖率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，后续实验选择中浓度糖通饮含药血清作为处理因素。见表1。

表1 不同浓度中药血清组细胞增殖情况(n=3)Tab.1 Cell proliferation in serum groups with different concentrations of traditional Chinese medicine(n=3)

2.3 HBZY-1细胞增殖情况

结果显示，与正常糖+空白血清组相比，高糖+空白血清组细胞明显增殖，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖+空白血清组相比较，高糖+最佳浓度糖通饮含药血清组细胞增殖增殖率均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；提示糖通饮含药血清可减轻HBZY-1细胞的增殖。见图2。

注：(1)与正常糖+空白血清组比较，P<0.05；(2)与高糖+空白血清组比较，P<0.05。图2 各组HBZY-1细胞的增殖情况(CCK-8，n=3)Fig.2 Cell proliferation in each experimental group(CCK-8，n=3)

2.4 HBZY-1细胞miR-21的表达以及Smad7、α-SMA mRNA表达

结果显示，与正常糖+空白血清组比较，高糖+空白血清组HBZY-1细胞的miR-21表达和α-SMAmRNA表达升高，Smad7 mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖+空白血清组细胞相比，高糖+最佳浓度糖通饮含药血清组HBZY-1细胞的miR-21 表达和α-SMAmRNA表达降低 ，Smad7 mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：(1)与正常糖+空白血清组比较，P<0.05；(2)与高糖+空白血清组比较，P<0.05。图3 各组HBZY-1细胞miR-21表达以及Smad7、α-SMA mRNA表达(n=3)Fig.3 Comparison of expression of miR-21,Smad7,andα-SMA mRNA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

2.5 HBZY-1细胞Smad7、α-SMA蛋白的表达

与正常糖+空白血清组比较，高糖+空白血清组HBZY-1细胞的Smad7蛋白表达降低，α-SMA蛋白表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与高糖+空白血清组HBZY-1细胞相比，高糖+最佳浓度糖通饮含药血清组HBZY-1细胞的Smad7蛋白表达增加，α-SMA蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为Smad7、α-SMA、GAPDH蛋白Western blot 灰度值，B为Smad7/GAPDH、α-SMA/GAPDH蛋白直条图；(1)与正常糖+空白血清组比较，P<0.05；(2)与高糖+空白血清组比较，P<0.05。图4 各组HBZY-1细胞Smad7和α-SMA蛋白的表达(n=3)Fig.4 Protein expression of Smad7 and α-SMA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

3 讨论

肾纤维化是DKD的主要病理改变之一，它的形成涉及系膜细胞的增殖和肾小球ECM增多等[10]。肾系膜细胞是一类包绕微血管或毛细血管的特殊的平滑肌细胞，占肾小球固有细胞总数的30%～40%，可以提供肾小球的结构支撑，调控肾小球的滤过功能。在生长因子、炎症因子、晚期糖基化终产物等因素刺激下系膜细胞过度分泌ECM，使ECM合成及降解失衡。系膜细胞发生肌成纤维细胞转分化(myofibroblastic transdifferentiation，MFT)也参与内皮及足细胞损伤和继发的小管间质损伤过程。因此肾系膜细胞在肾脏纤维化病灶的形成中具有重要作用[11-12]。α-SMA是系膜细胞发生肌成纤维细胞转分化MFT的重要标志物，在肾纤维化发生发展中起重要作用，α-SMA不仅促进肾小球系膜细胞增殖，同时通过多个作用环节导致ECM过度聚积，引起肾小球系膜区扩张、毛细血管基底膜增厚，导致弥漫性或结节性肾小球硬化和肾纤维化，从而成为DKD的关键病理特征[13-14]。本研究发现，高糖可以升高HBZY-1细胞中α-SMA的表达，促进HBZY-1细胞的增殖。

近年来，大量研究发现microRNA也参与了DKD的发生发展，该家族中的miR-21是调控代谢、炎症及纤维化的重要分子，普遍存在于肾脏纤维化疾病[15-17]。有研究发现，在DKD发展过程中，miR-21可直接作用于靶基因Smad7的3′-UTR部位，并且抑制其表达，从而促进DKD肾纤维化的进程[18-21]。本实验结果显示，高糖能使HBZY-1细胞内miR-21表达明显增加。

在中医学中，DKD按临床表现属于消渴并虚劳、肾劳、水肿等范畴，其基本病机为气阴两虚为本、痰瘀浊毒阻络为标[22]。根据DKD这一基本病机特点创制的中医复方糖通饮，是在六味地黄丸的基础上改熟地黄为生地黄，并配伍黄芪、丹参、地骨皮、草决明而成，既培补肝肾、调养气阴，又除标实之痰浊、通肾络之瘀阻[23]。根据现代药理学研究证实，黄芪具有预防肾脏系膜细胞早期增殖及糖基化终产物介导的细胞凋亡的作用[24]；丹参对肾脏具有抗肾纤维化、减轻肾脏细胞损害的作用[25]。本实验结果显示，糖通饮中药血清能降低HBZY-1细胞内miR-21 表达，增加Smad7 mRNA和蛋白的表达，降低α-SMA mRNA和蛋白表达，从而抑制HBZY-1细胞的增殖。表明糖通饮中药血清可以抑制HBZY-1细胞增殖、减少ECM沉积，其作用机制可能与调节miR-21、Smad7以及α-SMA的表达有关，本研究找到了糖通饮防治DKD的新靶点，为经验方糖通饮的临床应用提供新的理论依据。