微阵列基因芯片技术在新生儿遗传性耳聋筛查中的应用价值

葛玉东

(许昌市妇幼保健院 医学检验科，河南 许昌 461000)

遗传性耳聋(hereditary hearing loss，HHL)是一种临床常见的出生缺陷，部分患儿在出生后即对声音无反应，若不佩戴助听器、接受语言训练，则无法与外界正常交流且阻碍其智力发育，给其家庭及社会造成严重负担[1-2]。耳声发射(transi entevoked otoacoustic emission，TEOAE)与自动听性脑干反应(auto-mated auditory brainstem response，AABR)是新生儿听力筛查的主要方法，其中TEOAE主要是通过检测外耳道至耳蜗外毛细胞功能以判断受检者听力状况，灵敏度与特异度均较高，但受呼吸、环境噪声、中耳羊水、外耳道内胎脂等因素的影响，可能出现假阳性，且无法检出蜗后病变[3-4]。AABR不受新生儿意识的影响，可检出听神经功能障碍，判断耳聋性质，定位病变部位，但该检查方式对操作人员专业技术要求较高，所需费用高昂，耗时长，故而临床应用受到一定限制[5-6]。微阵列基因芯片是一种分子诊断技术，主要是采用微量点样、光导原位等方法将多肽分子、核酸片段、组织切片等生物大分子样品有序地固化于尼龙膜、玻片等支持物表面，而后与一组已标记的待测生物样品中靶分子反应，采用特定的扫描仪进行靶分子数量测定的检查方法，可识别特异性耳聋基因，且具有检查费用低、耗时短的优势[7]。鉴于此，本研究探讨微阵列基因芯片技术在新生儿HHL筛查中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究经医院医学伦理委员会审核批准。收集2020年1月至2021年10月于许昌市妇幼保健院接受HHL筛查的51 409例新生儿的临床资料。(1)纳入标准：①新生儿父母存在听力障碍；②新生儿父母听力良好，但其直系亲属存在听力障碍；③新生儿父母已经生育有听力障碍的小儿。(2)排除标准：①合并先天性小耳畸形；②合并先天性脑部发育不全。51 409例新生儿中男27 741例，女23 668例；胎龄37～41(38.82±0.64)周；出生体质量2 480～4 920 g(3 364.52±193.54)g；日龄3～19(7.82±2.03)d；自然分娩33 652例，剖宫产17 757例。

1.2 微阵列基因芯片技术检查采集新生儿足跟静脉血均匀滴在采血卡上，单独密封包装送至实验室，使用微阵列基因芯片(北京博奥生物)检测常见的4个耳聋基因中的15个位点[GJB2(235delC、299-300delAT、176-191de1、35de1G)、GBJ3(538C>T)，SLC26A4(IVS7-2A>G、1229C>T、2168A>G、1975G>C、1226G>A、1174A>T、IVS15+5G>A、2027T>A)、12SrRNA(1555A>G、1494C>T)]。微阵列基因芯片技术流程：(1)芯片制备，即采用组合化学或表面化学处理固相基质，而后将探针依据特定顺序排列在基片上；(2)样品制备，即提取mRNA，反转录cDNA，在待测的核酸片段上标记不同的荧光或同位素等作为靶片段；(3)杂交反应，即将cDNA与芯片探针结合，漂洗除去cDNA；(4)检测并分析芯片信号，即通过特定的扫描仪获取杂交后的信号，而后进行计算机分析。HHL微阵列基因芯片检测结果阳性的新生儿，进行基因测序检验，结果符合后通知家长领取检测报告，并提供遗传咨询。

1.3 观察指标针对HHL微阵列基因芯片检测结果阳性的新生儿进行基因测序检验，观察基因测序结果及杂合突变类型。以基因测序检验为金标准，分析微阵列基因芯片技术在HHL新生儿基因筛查中的诊断效能并观察其诊断新生儿HHL杂合突变类型与基因测序检验结果一致性。

2 结果

2.1 51 409例新生儿HHL微阵列基因芯片检测结果51 409例新生儿经HHL微阵列基因芯片检测，结果显示阳性2 694例(5.24%)，阴性48 715例(94.76%)。

2.2 HHL微阵列基因芯片检测结果阳性的新生儿基因测序检验结果经基因测序验证，2 694例HHL微阵列基因芯片检测阳性的新生儿均为阳性，其中GJB2基因杂合突变型1 379例(51.19%)，GJB3基因杂合突变型199例(7.39%)，SLC26A4基因947例(35.15%)，线粒体12SrRNA基因164例(6.09%)，双杂合突变型5例(0.19%)。

2.3 微阵列基因芯片技术诊断新生儿HHL杂合突变类型与基因测序检验结果的一致性分析微阵列基因芯片技术诊断新生儿HHL杂合突变类型与基因测序检验结果一致性较好(Kappa=0.884，P<0.05)。见表1。

表1 微阵列基因芯片技术诊断杂合突变类型与基因测序检验结果分析(n)

3 讨论

我国HHL患儿基因携带率约为4.5%，耳聋基因所致的HHL发病率较高[8]。听力异常可对新生儿语言发育及认知功能产生严重不良影响，增加其后期学习难度，甚至造成永久性残疾。现阶段，我国已经展开新生儿听力筛查，包括TEOAE与AABR等检查方式，可检出大部分HHL患儿。但仍有部分HHL基因携带者出生后无耳聋表现，而是在数月或数年后发病，进而造成常规新生儿听力筛查方法难以早期发现潜在耳聋，不利于早期采取预防措施，影响患儿预后。由此可见，推广HHL的基因筛查十分必要。

流行病学调查研究显示，GJB2基因突变、线粒体12SrRNA基因突变、SLC26A4基因突变是我国正常人群中携带率较高的致聋基因，运用适当的基因筛查方法进行基因诊断对提高HHL检出率具有积极意义[9]。本研究采用微阵列基因芯片技术筛查新生儿HHL，结果显示，51 409例新生儿中阳性2 694例(5.24%)。进一步经基因测序检验，结果显示，2 694例HHL微阵列基因芯片检测阳性的新生儿均为阳性，其中GJB2基因杂合突变型1 379例，GJB3基因杂合突变型199例，SLC26A4基因947例，线粒体12SrRNA基因164例，双杂合突变型5例。GJB2是HHL最常见的突变基因，GJB2基因编码产物跨膜蛋白Cx26在信息传递、物质交换中起到重要作用。而Cx26广泛分布于耳蜗的血管纹、耳蜗传导纤维、神经感觉上皮、基底细胞、螺旋凸缘等部位，是细胞间电解质、代谢物质、第二信使的重要通道，因此携带GJB2突变基因可大大增加耳聋概率[10-11]。携带GJB2突变基因的新生儿日常生活中需远离噪音，预防头部受伤，避免憋气、用力咳嗽等，一旦发现异常需及时就医。SLC26A4也是HHL常见的突变基因，其检出率仅次于GJB2，与大前庭水管综合征密切相关。同时，携带SLC26A4突变基因的新生儿可诱发主要氨基酸置换，还可引发剪接突变或移码突变，改变Pendrin蛋白的合成及功能，致使蛋白质运转障碍，打破细胞内外环境平衡，引起耳聋。携带SLC26A4突变基因的新生儿出生时大都无耳聋表现，受诱因刺激或随外界环境变化听力呈波动性下降，最终发展为耳聋[12-13]。因此，该基因突变携带者应禁止倒立或剧烈体育运动，预防感冒等外界刺激，以预防耳聋发生。线粒体12SrRNA突变基因与药物性耳聋密切相关，可导致氨基糖苷类药物性耳聋，其中1555A>G、1494C>T是常见的药物性耳聋的突变点位，线粒体12SrRNA基因突变可在12S rRNA的A区形成新的结合碱基对，由此生成的12S rRNA二级结构类似于细菌16S rRNA结构[14]。因此，携带线粒体12SrRNA突变基因的患儿对氨基糖苷类抗生素具有高度敏感性，需绝对禁止使用此类抗生素，以降低耳聋发生率。GJB3的538C>T突变点位可改变其编码Cx31蛋白的功能与结构，影响细胞间隙连接，引起HHL，但该突变基因检出率较低，其与HHL的关系仍需进一步观察探讨。

遗传学研究表明，人体基因中与耳聋相关的基因超过200个，通过诊断耳聋基因可筛选基因突变携带者，在耳聋家族史缺少的情况下可利用智能基因诊断出耳聋个体及亲属，从而及时采取干预措施[15]。微阵列基因芯片技术是一种耳聋基因筛查工具，固有的高效平行为其主要检测特点，其高度与耳聋基因高遗传异质性相契合，检测耳聋基因的潜力极高[16]。本研究结果显示，微阵列基因芯片技术诊断新生儿HHL杂合突变类型与基因测序检验结果一致性较好(Kappa=0.884)，表明微阵列基因芯片技术在新生儿HHL筛查中具有良好的应用价值。微阵列基因芯片技术将探针分子固化于支持物上，而后与标记的待测生物样品靶分子进行杂交，通过电荷偶联摄影像机或激光共聚扫描仪检测每个探针分子的杂交信号强度而获取待测生物样品靶分子的序列信息和数量。同时，通过统计芯片检测结果中的野生型与突变型的平均荧光信号值，设定二者之间的分界值，并采用软件自动判读，避免采用肉眼观察而出现错误，提高诊断准确度[17-18]。此外，微阵列基因芯片技术一次可检测多张芯片，一张芯片可同时检测多个个体，且试剂价格低廉，对仪器要求相对较低，具有低成本、高通量、耗时短等优势，能够有效满足临床需求。

综上所述，微阵列基因芯片技术在新生儿HHL筛查中具有良好的应用价值，可明确大部分患儿的基因携带情况，进而为早期听力损伤防护和干预提供指导。此外，不同家庭进行HHL基因诊断的目的不同，包括寻找治疗方案、确定耳聋原因、评估后代患病风险等，临床应依据家庭个体情况进行遗传咨询。