湖南娄底市犬弓首蛔虫流行状况及线粒体cox1和nad4序列变异分析

王先坤 ， 李 静

(娄底职业技术学院 ， 湖南 娄底 417000)

犬弓首蛔虫(Toxocaracanis)是一种重要人兽共患性寄生虫，可感染多种宿主，包括犬、猫和人类等[1]。含2期幼虫被犬或人类误食后在小肠内发育为幼虫，幼虫穿透肠壁通过血液循环进入各器官(如肺脏和肝脏)，甚至可进入人类神经系统，造成癫痫或失明等[2-3]。犬弓首蛔虫虫卵广泛存在于土壤、天然水(特别是死水)和食品表面，且虫卵可随病犬粪便排到外界，犬只体表可被含虫卵的粪污污染。由于部分儿童缺乏良好的卫生习惯，他们可能通过抚摸宠物犬(甚至是流浪犬)或在小区、公园等地区玩耍而接触犬弓首蛔虫虫卵，继而造成相应感染[4]。因此，了解地区犬弓首蛔虫感染情况及环境中虫卵污染情况对防控该病具有重要意义[5-7]。

目前关于弓首蛔虫的流行病学调查大多集中于宠物犬，对于流浪犬和环境中犬弓首蛔虫污染情况的调查研究相对较少，但这对该病的防控十分重要。近年来，湖南娄底市饲养宠物犬家庭比例逐渐上升，外界流浪犬数量也有上升趋势。娄底市部分季节气候潮湿，十分利于犬弓首蛔虫虫卵的生存，这在一定程度上提高了人类感染犬弓首蛔虫病的风险。因此，本试验于2021年3—9月对湖南省娄底市部分地区宠物犬和流浪犬弓首蛔虫感染情况进行调查；对受试地区附近小区及公园土壤和池塘水样品中弓首蛔虫虫卵污染情况进行检测；同时对获得的9个弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因序列进行扩增和测序，分析其遗传变异情况，旨在为该病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 犬弓首蛔虫阳性DNA样品于本实验室保存；DNA基因组提取试剂盒为天根通用生物技术有限公司产品；DL 2 000 DNA Marker和2×PCR预混液等均为北京瀚海拓新生物技术有限公司产品；PCR仪和移液器等均为美国吉尔森有限公司产品。

1.2 样品采集 从娄底市娄星区、双峰县、新化县和冷水江市收集犬粪便样品368份，其中宠物犬粪便样品(247份)采集于宠物医院、居民小区和宠物犬养殖基地等，流浪犬粪便样品(121份)采集于郊区公园和流浪犬收容所。环境样品(土壤和池塘水样品共104份)采集于公园和居民小区。记录每份样品采样时间、地点等信息后将其保存于4 ℃。

对部分检测为犬弓首蛔虫病阳性犬只进行药物驱虫，将形态学鉴定为犬弓首蛔虫的虫株标记后保存于70%酒精中。本试验共获得9个犬弓首蛔虫分离株，分别来自于娄星区(LDLX-1、LDLX-2和LDLX-3)、双峰县(LDSF-1和LDSF-2)、新化县(LDXH-1和LDXH-2)和冷水江市(LDLSJ-1和LDLSJ-2)。

1.3 粪便和土壤样品的犬弓首蛔虫虫卵检测 采用饱和盐水漂浮法对粪便或土壤样品中犬弓首蛔虫虫卵进行检测：取3.0 g粪便或土壤样品置于烧杯内，并加入30 mL 饱和生理盐水，用玻璃棒充分搅匀后以100目铜筛过滤；于室温将滤液静置40 min，用金属环(直径为0.5 cm)小心接触液面，其后将滤膜抖落在载玻片表面，并多次蘸取不同部位滤液，其后用盖玻片盖于载玻片上，在光学显微镜下观察是否存在犬弓首蛔虫虫卵[8]。

1.4 水样本的犬弓首蛔虫虫卵DNA检测

1.4.1 DNA基因组提取 将水样品混匀后取40 mL 置于50 mL离心管内，3 000 r/min离心15 min，弃去上清后再加入40 mL水样品，重复操作3～4次使沉淀重量达5 g左右，加入适量蒸馏水将沉淀混匀，取200 μL混合液用于DNA基因组提取，其操作步骤严格参考试剂盒说明书进行，DNA基因组保存于-20 ℃，待检。

1.4.2 引物合成及样品核酸检测 参照文献[9]合成检测犬弓首蛔虫ATP6 (ATP synthase subunit 6) 基因的特异性引物(PCR产物大小约300 bp)，其序列：ATP6-F1:GTTTGTTGTTTTGGGGGCTA；ATP6-R1:CCAAAGGACGAGAAACCTCA。PCR反应体系(25 μL)： 2×PCR预混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板3.0 μL和无菌水8.5 μL，每次PCR反应均设置阳性和阴性对照，其模板分别为已知犬弓首蛔虫DNA样品和无菌水。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35个 循环；72 ℃ 7 min。反应结束后取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察检测结果。

1.5 犬弓首蛔虫线粒体cox1和nad4基因序列扩增

1.5.1 DNA基因组提取 从75%酒精中取出犬弓首蛔虫虫株，用蒸馏水冲洗3次，每次5 min。用眼科剪剪取约2 cm虫体置于2 mL灭菌离心管内，加入适量灭菌蒸馏水和钢珠进行匀浆；取适量匀浆液用于DNA基因组提取，其操作步骤参考相应的DNA提取试剂盒说明书。

1.5.2 引物合成、PCR扩增及测序 参考文献[10]合成用于扩增犬弓首蛔虫线粒体cox1(JB3和JB4.5)基因序列的引物。扩增线粒体nad4所用引物：Nad4-F:ATAATGGAGTTGTTATTATTTTC；Nad4-R:CACCAAAGGAATAGCAAAGC。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR预混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL和无菌水9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(cox1基因)或90 s(nad4基因)，共35个循环；72 ℃ 7 min。取PCR阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序并拼接。

1.6 序列分析 从GenBank数据库下载具有代表性的犬弓首蛔虫相关序列，应用DNASTAR软件分别对虫株线粒体cox1和nad4核苷酸序列同源性进行比对分析；以DnaSP 5.0软件分析序列核苷酸多样性、单倍型多样性和平均核苷酸差异等；以MEGA 7.0软件中临接法(NJ)构建系统进化树，其模型为Kimura-2-parameter，重复自举检测1 000次。

2 结果

2.1 娄底市犬弓首蛔虫感染情况调查统计 检测发现部分样品中存在犬弓首蛔虫虫卵，其为黄褐色、圆形虫卵，且卵壳较厚，外壳表面凹凸不平，符合犬弓首蛔虫虫卵形态学特征(图1)。经统计该地区被调查样品犬弓首蛔虫虫卵平均检出率为11.86%(56/472)；其中娄星区来源样品阳性率最高，为16.48%，而双峰县最低(6.45%)。不同样品感染情况统计结果如表1所示，宠物犬来源粪便样品的犬弓首蛔虫虫卵检出率为11.74%,较流浪犬(17.36%)低；公园和小区土壤样品中犬弓首蛔虫虫卵检出率分别为9.09%和3.92%；采用PCR法检测20份被调查水样品中是否存在犬弓首蛔虫虫卵，结果发现仅有1份公园来源水样品中含有犬弓首蛔虫虫卵核酸(图略)。

表1 娄底市犬弓首蛔虫感染情况调查

2.2 犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因序列的PCR扩增 9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因均成功扩增，其片段大小约500 bp和1 200 bp，与预期片段大小相符，无非特异性条带(图2)，提示成功扩增出犬弓首蛔虫的cox1和nad4基因序列。

图2 犬弓首蛔虫线粒体cox1和nad4基因的PCR扩增

2.3 测序及同源性分析 对测序结果进行拼接与比对，发现9个分离株线粒体cox1和nad4基因序列分别为424 bp和1 197 bp，其A+T含量分别为61.33%～62.28%和67.47%～67.72%。9个虫株线粒体cox1和nad4核苷酸序列同源性为99.4%～100.0%和98.7%～100.0%；进一步分析发现，本试验获得虫株cox1和nad4核苷酸序列与已知犬弓首蛔虫对应序列同源性分别为99.2%～99.7%和98.6%～99.6%；与狮弓蛔虫(Toxascarisleonina)、人蛔虫(Ascarislumbricoides)、猪蛔虫(Ascarissuum)和狸猫弓蛔虫(Toxocaratanuki)、犬钩口线虫(Ancylostomacaninum)对应序列同源性均低于90%。

2.4 遗传多样性 本试验获得的9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因序列检测到单倍型数量分别为4个和5个；其总单倍型多样性分别为0.792±0.012和0.843±0.013；核苷酸多样性分别为0.007±0.002和0.006±0.003；平均核苷酸差异分别为1.958和2.062。

2.5 系统遗传进化分析 将线粒体cox1和nad4基因进行串联，并用MEGA 7.0软件中NJ法构建系统进化树。结果如图3所示，本试验获得的9个犬弓首蛔虫分离株具有高度同源性，与已知犬弓首蛔虫分离株(JF780944、MK913433、MT359315和MT942614)在进化树上位于同一分支；与其他蛔虫属相比，犬弓首蛔虫、狮弓蛔虫(JF780947)和狸猫弓蛔虫分离株(AB446546)聚为同一群，与猪蛔虫(MZ008307)和人蛔虫分离株(MK792813)所属分支相隔较远。上述结果再次证明本试验获得分离株为犬弓首蛔虫。

图3 基于线粒体cox1和nad4基因串联序列构建犬弓首蛔虫系统进化树

3 讨论

犬弓首蛔虫的终末宿主是犬科动物，其感染性虫卵可随患犬粪便排出，从而污染粪污、附近土壤或水源，人类(特别是儿童)可能因接触被虫卵污染的粪污、土壤或水源而误食感染性虫卵导致患病。因此，对犬只弓首蛔虫感染情况及环境(土壤和水源)虫卵污染情况进行调查可初步评估该病原对人类健康的威胁。本试验结果显示，娄底市宠物犬弓首蛔虫虫卵检出率较流浪犬低，这可能是由于流浪犬长期缺乏营养导致抵抗力较差，且在外界环境中更容易接触犬弓首蛔虫虫卵，却无法得到有效药物驱虫，导致其感染率较高。总体而言，娄底市犬弓首蛔虫病感染情况和湖南衡阳市(13.28%)[11]差异较小，但低于重庆市(77.03%)、扬州市(30.65%)和湖南益阳市(54.9%)[12-14]，说明我国不同地区犬弓首蛔虫病流行情况存在差异，但仍然较为严重。值得注意的是，本试验在犬猫经常出没的小区和公园土壤样品中也检测到了犬弓首蛔虫虫卵存在，这与卢祖鹏等[15]的调查结果一致。此外，部分公园池塘水样品中也存在犬弓首蛔虫虫卵，由于小孩在公园或小区内经常接触土壤或水，可能导致他们接触到感染性虫卵，因此对小区和公园环境定期进行打扫和消毒十分必要。

研究表明，线粒体cox1和nad4基因序列可作为鉴定蛔虫的分子标记[10,16]。本试验结果显示，9个弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因序列种内变异率分别为0.0%～0.6%和0.0%～1.3%，可见犬弓首蛔虫线粒体nad4基因序列较cox1基因序列碱基变异率更高，与龚腾芳等[17]的研究结果一致[17]。基于线粒体cox1和nad4基因串联序列构建系统进化树，结果显示，本试验获得虫株与已知犬弓首蛔虫分离株属于同一分支，与其他虫株所属分支相隔较远，这说明犬弓首蛔虫cox1和nad4基因种内变异远低于种间变异，提示线粒体cox1和nad4基因序列可作为犬弓首蛔虫的分子鉴定标志物。进一步遗传多样性分析结果显示，9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因核苷酸多样性均低于0.01，分别为0.007±0.002和0.006±0.003，对于绝大部分寄生虫来说核苷酸多样性低于0.01被认为变异率较低[16]，故本试验获得的犬弓首蛔虫分离株遗传变异程度相对较低。

综上，湖南省娄底市犬(宠物犬和流浪犬)弓首蛔虫病流行情况相对严重，同时在犬只经常出没的公园和小区环境(土壤和水)样品中也检测到犬弓首蛔虫虫卵。此外，本试验获得的9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4基因序列变异程度和遗传多样性均较低，且这2个基因均可作为鉴定犬公首蛔虫的分子标记。由于该病原的流行对人类健康存在巨大威胁，故相关人员应引起对该病的重视。