结核分枝杆菌复合群耐药性研究进展

亓 菲 ， 樊晓旭 ， 刘蒙达 ， 孙淑芳 ， 范伟兴 , 温建新

(1.青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ; 2.中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东 青岛 266032)

结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)的成员包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，bTB)、非洲分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti)和山羊分枝杆菌(Mycobacteriumcaprae)等。其中结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别是人结核病、牛结核病的主要病原菌。至今，结核病仍是威胁人类社会及畜牧业发展的重要人兽共患传染病。世界卫生组织(WHO)估计，2019年全球有1 000万(890万～1 100万)人感染了结核病，近年来这一数字相对稳定。在所有结核病病例中，8.6%是艾滋病病毒感染者。从地理分布上看，2019年结核病病例大多分布在东南亚(44%)、非洲(25%)和西太平洋(18%)。从全球分布看，印度(26.0%)、印度尼西亚(8.5%)和中国(8.4%)所占比例较高[1]。近年来，由于抗生素过度和不当使用，出现了多种耐药结核菌，包括对一线结核药物异烟肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RIF)具有耐药性的耐多药结核菌株(MDR)及在MDR基础上对氟喹诺酮类药物以及二线抗结核注射剂(卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那)中的至少1种耐药的广泛耐药结核菌株(XDR)。抗生素耐药性(AMR)已成为全球结核病防控的难点。据WHO统计，2019年3.3%的新结核病例和17.7%的先前治疗的病例是耐多药结核病。2019年，新发利福平耐药结核病病例约50万例(其中78%为耐多药结核病)。全球结核病负担最大的3个国家分别是印度(27%)、中国(14%)和俄罗斯联邦(8%)。联合国报告预计，如果对抗生素耐药不加控制，到2050年每年可能导致多达1 000万人因患结核病而死亡。鉴于此，本文综述了常见抗结核药物及其耐药研究进展，总结了结核耐药监测与检测方法，为结核病耐药性研究提供参考。

1 MTBC的耐药机制及常见抗结核药物的耐药情况

1.1 MTBC的耐药机制 耐药性是结核病治疗的主要障碍，对全球公共卫生和治疗提出了挑战。尽管抗结核药物有疗效，但仍出现了MTBC的耐药分离株。多种机制促进了 MTBC耐药性的进化，例如代偿性进化、上位性、克隆干扰、细胞包膜不渗透性、外排泵、药物降解和修饰、靶标拟态和表型药物耐受性[2]。结核病治疗失败可能是由于内在(天然存在的高水平抗生素耐药性)和外在(新获得的突变)的抗生素抗性[3]。

1.2 常见抗结核药物的耐药情况

1.2.1 利福平(RIF) MTBC的rpoB基因编码 RNA聚合酶β-亚单位，含有RIF耐药决定区域(RIF ampicin resistance-determining region，RRDR)，即密码子第507～533位的区域(长度为 81 bp)，此区域发生突变或缺失时，RIF与RNA聚合酶β-亚基的亲和力降低，进而表现出对RIF的耐药性。目前发现超过95%的RIF耐药与rpoB基因中81个碱基对片段的突变有关，其中密码子第526位或第531位的突变占65%～86%，会产生对RIF的高度耐药，而第511、516、518位和第522位密码子的突变与MTBC对利福平低水平的耐药相关[4]。据报道，80%的利福平耐药株同时对异烟肼耐药，因此利福平耐药被看作是MDR的一个主要标志[5]。

1.2.2 异烟肼(INH)KatG基因：INH发挥抗菌作用需借助KatG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶，当KatG基因发生突变或缺失，导致过氧化氢酶-过氧化物酶的合成受阻，活化INH的能力减弱，进而产生耐药。在全球范围内，观察到的所有表型异烟肼耐药性中有64%与KatG基因315位点突变有关。

inhA基因：当inhA基因发生突变、缺失或插入时，会降低INH活化产物与inhA活性部位的亲和力，导致耐药；inhA突变也会发生在启动子位置，造成inhA产物的过度表达，超出INH的抑制范围而产生耐药。inhA最常见的突变是第94位密码子丝氨酸→丙氨酸，启动子区域-15(C→T)的突变也较为普遍，占耐药突变类型的10%～34%[6-7]，该突变引起对INH低水平耐药。启动子第8位(T→G)、第16位(A→G)和第24位(G→T)密码子的突变也会导致对INH产生耐药。

1.2.3 乙胺丁醇(Ethambutol，EMB) MTBCembB基因第306位密码子的修饰导致糖基转移酶的结构随之改变，被认为是导致MTBC临床分离株对EMB耐药的主要机制[8]。通过检测密码子第296～497位的embB区，以及在第-8～-21位包括embC～embA基因间隔区，可以提高基于embB密码子第306位检测EMB耐药性的诊断方法的敏感性[9]。

1.2.4 吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA) 吡嗪酰胺酶的功能失调是由于其编码基因(pncA)突变，以及启动子区域损害蛋白的表达[10]，导致PZA无法转化为吡嗪酸，致使药物无法发挥作用。pncA基因中，D12A、D49N、T47A、L85P和T135P突变与PZA抗性显著相关[11]。

1.2.5 链霉素(Streptomycin，STR) 据WHO报告显示，在全球范围内，结核病新病例和以前治疗过的病例中，链霉素耐药率分别为10.9%(参考范围：8.0%～13.7%)和20.1%(参考范围：12.2%～28.0%)。Spies等[12]进行的一项研究表明，27%的链霉素耐药菌株出现gidB突变，并且与低水平链霉素耐药相关，这些菌株的rpsL或rrs基因没有突变[12]。rpsL基因突变率高于rrs基因，rpsL基因突变占STR耐药菌株的13.2%～80.0%，rrs突变占0%～28%。rpsL突变位点最常见的为第43位(AAG→AGG)和第88位(AAG→AGG)。

1.2.6 氟喹诺酮(Fluoroquinolone，FQ) 氟喹诺酮类药物被证明是最有效的二线抗分枝杆菌药物，对氟喹诺酮类药物抗性的遗传机制是DNA旋转酶变化的结果，特别是gyrA(第74～113位密码子)和gyrB(第500～538位密码子)的喹诺酮耐药性决定区(Quinolone resistance determining region，QRDR)突变[13]。一项系统性研究表明，大约60%～90%的具有FQ抗性的MTB临床分离株在gyrA的QRDR中发生突变，我国有85%的突变发生在第88～94位密码子中。gyrB突变也与FQ抗性相关，但敏感性和特异性较低，它们通常与典型的gyrA突变共同发生，并且最常见于第500位和第538位密码子。gyrA和gyrB中的双重突变可产生较高水平的抗性。

1.2.7 阿米卡星(Amikacin，AMK)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)和卷曲霉素(Capreomycin，CAP)rrs、tlyA、eis启动子和gidB基因突变与MTBC对AMK、KAN和CAP的抗性相关。rrs基因编码16S rRNA，rrs基因最常报道的突变包括A1401G、C1402T和G1484T。在这3种耐药菌株的gidB基因中，G102缺失的出现频率很高(17%～20%)，也可见T230C、C286T、T104G和A254G的突变[14]。

1.2.8 D-环丝氨酸(D-cycloserine) D-环丝氨酸耐药相关基因包括alr、ddlA、ald和cycA。D-环丝氨酸通过竞争性抑制丙氨酸代谢途径中的2种酶[丙氨酸消旋酶(由rv3423c编码，alr)和D-丙氨酸连接酶(由rv2981c编码，ddlA)]发挥抑菌作用。有研究证明，L-丙氨酸脱氢酶ald(Rv2780)功能缺失在体外对D-环丝氨酸产生耐药性[15]。

1.2.9 乙硫酰胺(Acetamide) 由于乙硫酰胺作用于与异烟肼(inhA基因编码的inhA蛋白)相同的靶蛋白。研究表明，乙硫酰胺耐药与低水平异烟肼耐药显著相关，ethA突变占乙硫酰胺耐药菌株的47%，inhA及其启动子区域的突变占55%[16]。

1.2.10 利奈唑胺(Linezolid，LZD) 一些临床研究表明，LZD治疗耐多药结核病有效，但耐多药结核分枝杆菌的耐药率在1.9%～10.8%。rrl基因G2061T或G2576T突变可能导致结核分枝杆菌体外分离株对LZD产生抗性。最近的一项研究表明，在7个耐LZD的结核分枝杆菌突变体中的6个中发现了编码L3核糖体蛋白的rplC基因存在T460C突变[17]。

1.2.11 氯法齐明(Clofazimine，CFZ) 抗麻风病药物氯法齐明近几年被重新用于治疗耐多药结核病，WHO已将其地位从第5组抗结核药物提升为耐多药结核病患者的核心二线药物。目前发现的CFZ耐药基因有rv0678、rv2535c和rv1979c，其中rv0678突变是氯法齐明耐药的主要机制[18]。

2 耐药监测与检测方法

2.1 药物临界浓度法 将标准培养物接种在无药物培养基和含有待测抗结核药物分级浓度的培养基上，测试每种药物在不同浓度下，抑制细菌生长的效果。发挥抑制效应的最低浓度即最小抑菌浓度(MIC)。这是一种在固体介质上的间接方法，周转时间(TAT)约4周，可以作为直接或间接的方法使用。但此方法耗时较长，且需精确配置试验所需的菌悬液浓度以减少误差。

2.2 自动化液体培养系统 BACTEC MGIT 960系统目前被WHO推荐为二线DST的黄金标准。该系统是一个自动化的、连续的监测系统，它使用富含14C标记棕榈酸作为唯一碳源的Middlebrook 7H9液体培养基(12B小瓶)。用BACTEC MGIT-960系统获得耐药菌株药敏试验结果的平均时间为6 d，范围为5～14 d，与固体培养基的4周时间相比大大缩短。

2.3 硝酸还原酶法(NRA) NRA基于MTBC将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力，可通过向培养基中添加化学试剂(格里斯试剂)来检测。诱导颜色变化后，可在孵育的7～14 d内读取结果。直接和间接NRA对INH、RIF、STR和EMB耐药性检测的灵敏度和特异性与常规方法相当[19]。

2.4 基于PCR的检测方法 GeneXpert MTB/RIF通过分子信标和半巢式实时PCR技术，能在2 h内完成结核病的诊断和RIF耐药性检测。GenoType MTBDRplus分析是一种定性的体外试验，可以检测痰中的MTB DNA以及与rpoB基因、katG基因和inhA调节区基因相关的突变。

2.5 基因序列测定 DNA测序是分子生物学方法金标准，可以确定DNA的部分或整个核苷酸序列信息。焦磷酸测序主要用于短读测序和单核苷酸多态性(SNP)分析，该方法能够缩短TAT时间，从DNA提取到获得结果仅需6 h。但是，焦磷酸测序测出的DNA序列长度较短，仅能够测得20～50个核苷酸。全基因组测序(WGS)可识别细菌所有基因的遗传多态信息[20]，包括SNP和小的插入和缺失[21]。

3 牛分枝杆菌耐药情况

3.1 牛结核病的药物治疗 我国曾在奶牛结核病药物治疗上做了一些试验研究，获得过一定的结果，所应用的治疗药物均以抗结核杆菌药物为主，如异烟肼、对氨基水杨酸钠和链毒素，治疗后患牛在临床上有所好转，产奶量增高。对结核菌素阳性反应的犊牛早期应用异烟肼或异烟腙连续进行3～6个月的治疗，也获得了良好的治疗效果。意大利也曾有应用异胭肼治疗牛结核在临床上得到改善的报道。抗生素治疗牛结核虽然显示出一定的疗效，但综合各种实际因素来看，结核病牛治疗价值不大，所以近年来一般做淘汰处理。

3.2 牛分枝杆菌耐药情况 一项对从牛淋巴结中分离的bTB的耐药性进行的研究发现，RIF耐药基因突变位点集中于rpoB基因的第513(CAA→AAA)、516(D→V)、531(TCG→TTG)、521(CTG→CCG/CTT)位和第526(CAC→GAC)位密码子[22]。也有研究表明，bTB的INH耐药基因突变常发生于katG基因的第315(AGC→ACC)、463(CTG→CGG)位和第506(GAG→AAG)位密码子；inhA启动子的第-15(C→T)、-16位(A→G)和第-8位(T→C/A)[23]。一项对bTB链霉素耐药性进行的研究中发现，在rpsL基因中存在密码子第43位(AAG→AGG)的非同义突变，在rrs基因和gidB基因中未见相关耐药基因的突变[24]。pncA基因的第57位氨基酸发生突变使bTB对吡嗪酰胺具有天然耐药性。

3.3 用药物防治牛结核病的弊端 用抗生素治疗结核病牛往往不能获得理想的疗效，即使人结核病接受多种药物治疗几个月也是如此；牛分枝杆菌对用于治疗人类结核病的一线药物之一(吡嗪酰胺)具有天然耐药性，当前人结核菌株多重耐药问题已经成为严重的公共卫生问题，为消除耐药牛分枝杆菌菌株感染人类的风险，必须确保避免对动物结核病实施药物防治而人为选择出耐药的牛分枝杆菌菌株；如果对结核感染牛实施治疗，必须考虑治疗期间的传染性控制问题，并严格遵守奶和肉休药时间的规定。

4 耐药性解决策略

4.1 贯彻“同一健康”理念，扩大监测覆盖范围 尽管牛一般不接受结核病治疗，但从牛体分离到了耐药结核菌。在环境中，如废水系统和存在废水流失的环境，如河流、溪流和海洋，可能是耐药细菌的滋生地。人类接触动物、外界环境，都可能感染耐药结核菌。因此，要秉承“人—动物—环境”这一“同一健康”理念，扩大对耐药结核的监测覆盖范围。

4.2 进一步研究结核耐药机制 例如乙硫酰胺ethA基因的突变具有多样性，目前尚未发现其突变规律。结核分枝杆菌利奈唑胺耐药相关突变的遗传分析信息有限，需要进一步研究耐药机制，为未来检测和药物的改进、开发提供参考。

4.3 改进现有检测方法，开发新的快速诊断方法 全基因组测序(WGS)仍然是结核病菌株分析的一种相对新颖的方法。到目前为止，还没有包含所有分析阶段的商业试剂盒，而且实验室技术和数据处理方面尚未完全标准化，因此需要进一步优化。应开发更敏感、特异的快速诊断方法，及时发现菌株的耐药情况，并指导耐药性结核的治疗，防止耐药进一步发展。

4.4 开发作用于已知靶点、新靶点的药物 随着药物的使用，对于某些已知靶点的抑制效果下降。例如，异烟肼是一种需要通过MTBCKatG进行生物激活的前药，近70%的INH耐药菌株显示KatG中的突变，这可能导致无法激活INH前药。为了克服KatG的突变，需要合成不需要KatG激活的INH类似物，针对已知靶点开发新药。此外，需要针对新的潜在靶点开发药物。

4.5 探索新的药物组合 一线药物利福平与异烟肼合用可以减少耐药性的产生。对严重感染，可以合用吡嗪酰胺、利福平和异烟肼。一项名为PaMZ的研究是第1个接受临床试验的新型多药结核病治疗方法，它包括PA-824、PZA和莫西沙星的联合方案[25]。PaMZ有可能治愈药物敏感结核病和某些耐多药结核病，同时将治疗时间从2年缩短到4个月。在未来，应根据地区的耐药性监测情况，合理用药，并探索新的药物组合，降低耐药结核出现的可能性。

5 展望

抗结核药物的使用不当让多重耐药菌和广泛耐药菌不断出现，更加刺激了对结核分枝杆菌耐药基因分子机制的研究。目前，基因芯片技术的兴起，耐药基因位点的测定在临床工作中已经得到广泛的应用，但仍然缺乏一种100%敏感和特异的方法来诊断耐多药结核病。当前形势下，新的药物和新的药物组合的开发也变得迫在眉睫。因此，需要更多的关注和研究，在不同的环境中开发有效和廉价的方法来克服这一世界性问题。