大果木姜子黄酮的提取工艺优化及抗氧化活性研究

魏 晴， 陈代凤， 覃亚雪， 梁珊珊， 孙庆文

（1.贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025；2.贵州中医药大学大果木姜子研究中心，贵州贵阳 550025；3.贵州中医药大学植物多糖研究中心，贵州贵阳 550025）

米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）为 樟 科 樟属植物，多生长于我国西南地区，以贵州为主。 其干燥成熟果实为大果木姜子， 是贵州十大苗药之一（贵州省药品监督管理局，2003）。大果木姜子具有温中散寒，理气止痛的作用。通常人们把它当作治疗胸腹疼痛等疾病的药物（王军才等，2015）。近年来对大果木姜子的化学成分和药理学方面研究比较深入（刘杰和郭江涛，2019；李建银等，2003）。研究发现， 大果木姜子中主要成分为黄酮类。 黄酮类化合物具有抗氧化活性， 对自由基的产生有抑制作用， 并且对ROS、RNS 和其他活性物质具有清除活性 （Bartekova 等，2018；Xue 等，2017）。由于黄酮类化合物的特定化学结构、 结构内的特定取代模式以及拥有能够充当供氢分子的酚氢，因此， 具有抗氧化活性 （Hana 等，2021；Vladimir等，2020；Monika 等，2020）。 基于此推测大果木姜子发挥抗氧化作用的部位可能为黄酮组分。

超声法具有提取速度快、溶剂用量少、提取率高、不影响物质活性与化学结构的特点，也是目前实验室阶段使用非常广泛的一种提取技术（王晓宏和宋燕，2019）。 响应面法是一种基于三水平二阶试验设计和数学建模的优化方法， 比正交设计更简化，比均匀设计更全面，可有效减少试验的次数，精密度高，预测性能好（徐仕娟等，2021）。 目前， 鲜见有关大果木姜子黄酮提取工艺及抗氧化活性的研究报道。因此，本试验以大果木姜子黄酮为研究对象，以提取时间、液料比、超声功率、乙醇浓度、 超声温度为考察因素， 以黄酮含量和对DPPH 清除率为考查指标， 优化大果木姜子黄酮最佳提取工艺， 为大果木姜子黄酮类成分的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 药材产地为贵州省黔南州罗甸县坝碰村， 经贵州中医药大学药学院鉴定为米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）的果实，大果木姜子。

芦丁标准品（纯度＞98%），北京万佳标准物质研发中心；95%乙醇，分析纯，南京化学试剂股份有限公司；DPPH，美国Sigma-Aldrich 公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备 UV7 紫外可见分光光度计（梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；HH-600型恒温水浴（上海一科仪器有限公司）；FB224 电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；KQ-500DE 超声波清洗仪 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将新鲜的大果木姜子置于阴凉处晾干，除去枝梗和杂质，粉碎，然后过40 目筛，即得大果木姜子粉末，备用。

1.3.2 黄酮提取的单因素试验

1.3.2.1 提取时间对各指标的影响 分别称取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），超声功率80 W，乙醇浓度70%，超声温度60 ℃，提取时间分别为25、30、35、40、45 min 进行提取，考察不同提取时间对各指标的影响。

1.3.2.2 超声功率对各指标的影响 分别称取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取时间30 min，乙醇浓度70%，超声温度60 ℃，超声功率分别为20、40、60、80、100 W 进行提取，考察不同超声功率对各指标的影响。

1.3.2.3 液料比对各指标的影响 分别称取大果木姜子粉末5 g，按照提取时间30 min，超声功率80 W，乙醇浓度70%，超声温度60 ℃，液料比分别 为10：1、20：1、30：1、40：1、50：1（mL/g）进 行 提取，考察不同液料比对各指标的影响。

1.3.2.4 乙醇浓度对各指标的影响 分别称取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取时间30 min，超声功率80 W，超声温度60 ℃，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行提取，考察不同乙醇浓度对各指标的影响。

1.3.2.5 超声温度对各指标的影响 分别称取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取时间30 min，超声功率80 W，乙醇浓度70%，超声温度分别为40、50、60、70、80 ℃进行提取，考察不同超声温度对各指标的影响。

1.3.3 多评价指标检测方法

1.3.3.1 黄酮含量测定 黄酮标准曲线的绘制：参考徐仕娟等（2021）的方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为：y=2.2766x-0.0057，R2=0.9997。样品中黄酮含量的测定： 样品中黄酮含量的测定也参考徐仕娟等（2021）的方法，黄酮含量计算公式如下：

式中：C 为样品中黄酮浓度，mg/mL；D 为样品溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积，mL；m为样品的质量，g。

1.3.3.2 抗氧化活性的测定 分别精密吸取各设定条件下提取的大果木姜子黄酮提取液0.2 mL置于10 mL 容量瓶中， 用95%乙醇定容摇匀摇匀。 再分别吸取各样品2 mL 并加入2 mL DPPH，暗室放置30 min 后在517 nm 下测定吸光度（Ai）， 再分别吸取各样品2 mL 加入2 mL 95%乙醇，摇匀后测定吸光度（Aj）。此外，吸取2 mL 95%乙醇和2 mL DPPH 于试管中， 快速测定吸光度（A0）。每个样品测定3 次，取平均值计算各设定条件下提取的大果木姜子黄酮对DPPH 的清除率（ 张 鹏 等，2021；Hana 等，2021；Bartekova 等，2018）。

DPPH 自由基清除率%=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.3.4 总评归一-响应面法优化超声提取工艺参数 对提取效果进行评价仅仅使用黄酮含量作为评价的指标不足以代表效果的优劣，故选用Hassan 的方法对黄酮含量和清除率2 个指标进行归一化处理（吕明月等，2021；牛晓静等，2019），2 个指标都是取值越大越好， 计算公式为di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin），Ymin 为 指 标 中 最 小 值，Ymax 为指标中最大值。 总评归一值OD=（d1+d2+d3+…dk）/k（k 为指标数）。

根据单因素试验结果， 选取对试验影响较大的因素即提取时间、液料比、超声功率，以黄酮含量和清除率为评价指标， 并选用OD 值作为响应值进行综合评分， 采用三因素三水平响应面法对试验进行设计，设计因素与水平见表1。

表1 试验因素水平及编码

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同提取时间对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响 由表2 可知， 在固定其他条件下，提取时间在25 ～35 min，随着提取时间增长，黄酮含量增高， 清除率也越高。 提取时间为35 min 时各指标达到最高值。 40 min 及以后各指标含量略有下降。 这可能是因为随着提取时间的延长，使得组织细胞破碎程度增加，细胞中其他可溶性杂质溶出，导致黄酮含量降低，故抗氧化活性也降低。

表2 不同提取时间对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响

2.1.2 不同超声功率对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响 由表3 可知， 在固定其他条件下，超声功率在20 ～60 W，随着超声功率增加，黄酮含量增高，清除率也越高。 超声功率为60 W时各指标达到最高值。 当超声功率大于60 W 后各指标含量略有下降。 可能是由于超声功率过大导致黄酮结构被破坏， 同时随着功率增加体系温度也会升高， 使得部分热不稳定的黄酮类化合物被分解，导致黄酮含量降低，抗氧化活性降低。

表3 不同超声功率对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响

2.1.3 不同液料比对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响 由表4 可知，在固定其他条件下，液料比在10：1 ～40：1（mL/g），随着液料比增长，黄酮含量增高， 清除率也越高。 液料比为40：1（mL/g）时各指标达到最高值。 超过40：1（mL/g）后各指标含量略有下降。 这可能是因为当液料比为40：1 时，溶液中黄酮类物质已基本溶出，继续增大溶剂量会造成其他可溶性杂质成分的溶出，干扰黄酮含量的测定。

表4 不同液料比对大果木姜子黄酮含量和清除率的影响

2.1.4 不同乙醇浓度对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响 由表5 可知，固定其他条件下，乙醇浓度在50% ～70%， 随着乙醇浓度增加，黄酮含量增高，清除率也越高。 乙醇浓度为70%时各指标达到最高值。当乙醇浓度增多，各指标含量显著下降。 这是由于高浓度的乙醇会增加溶液的溶解度，使其他可溶性杂质被提取出来，故黄酮含量降低，抗氧化活性降低。

表5 不同乙醇浓度对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响

2.1.5 不同提取温度对大果木姜子黄酮含量和抗氧化活性的影响 由表6 可知， 在固定其他条件下，温度在40 ～60 ℃，随着提取温度升高，黄酮含量增加，DPPH 清除率也越高。 提取温度为60 ℃时各指标达到最高值，超过60 ℃后各指标含量显著下降。原因可能随着提取温度的升高，使得部分黄酮类化合物结构改变，苯环被破坏，最终导致黄酮含量降低，抗氧化活性降低。

表6 不同提取温度对大果木姜子黄酮含量和清除率的影响

2.2 总评归一-响应面法优化超声提取工艺参数结果

2.2.1 试验设计及结果 根据单因素试验结果，选取对试验影响较大的因素即提取时间、液料比、超声功率三个因素，以抗氧化活性、黄酮含量为评价指标，并选用OD 值作为响应值进行综合评分，采用三因素三水平Box-Behnken 响应面法对试验进行设计，试验设计及结果见表7。

表7 响应面设计及结果

2.2.2 建立响应面模型拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 软件，以提取时间、液料比、超声功率为考察因素， 以黄酮含量和抗氧化活性为评价指标，OD 值评分为响应值对试验结果进行回归方程拟合得到回归方程为：OD 值=0.98+0.046A-0.014B-0.30C +0.044AB-5.984E-003AC+0.019BC-0.28A2-0.33B2-0.34C2（A、B、C 分别代表提取时间、超声功率、液料比），并对响应面模型进行方差分析及显著性检验，其结果见表8。

由表8 可知，该模型P＜0.0001，说明此模型差异具有统计学意义， 矫正系数R2Adj=0.9948，预测复相关系数R2=0.9977，预测相关系数R2（Pred）=0.9714，与预测复相关系数接近，说明偏差在合理范围内，实际值和预测值拟合度比较好。失拟项F=3.752E-003，P=0.0904＞0.05 不显著， 说明选择的模型对该试验的拟合度较好。 变异系数CV 为4.88%，说明该模型相关性好，可用该拟合回归方程对不同条件下大果木姜子黄酮的OD 值进行分析。液料比对大果木姜子黄酮OD 值影响较大，其次为提取时间。由表8 可知，A、C、AB、A2、B2、C2的P＜0.05，以上因素对黄酮OD 值影响显著，其他因素对黄酮OD 值影响不显著。 由F 值可知，3 个因素对大果木姜子OD 值影响程度的大小顺序为：液料比＞提取时间＞超声功率。

表8 基于多指标总评归一评分的回归模型方差分析及显著性检验

2.2.3 响应面优化分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 软件做超声提取工艺参数的Box-Behnken响应面3D 图及等高线分析图，见图1，通过其拟合图形分析提取时间、超声功率、液料比对OD 值的影响。 由图可知，等高线越密集，中间形状呈椭圆形或圆形， 响应曲面越陡峭说明该因素变化对响应值影响大，且两因素之间的交互作用大，反之表明两因素之间的交互作用对响应值的影响较小。 结合表8 的P值和图1 可知A、C、AB、A2、B2、C2因素对OD 值均具有显著性（P＜0.05），A 和C对响应面弧面影响较大。 通过求解回归模型方程得到最佳超声提取工艺参数为： 提取时间34.93 min，超声功率59.37 W，液料比39.67:1（mL/g），此条件下OD 值为0.9847。

图1 超声提取工艺参数的Box-Behnken 响应面3D 图及等高线分析图

2.2.4 工艺验证 为检验试验方法的可靠性，将对优化后的工艺参数进行3 次平行试验， 同时考虑到优化实际操作的可行性， 最终将试验参数定为：提取时间35 min，超声功率60 W，液料比40:1（mL/g）， 得到的OD 均值为0.9910， 与预测值0.9847 相比偏差为0.09%， 说明本试验所建模型预测性较好且稳定。 故基于总评归一-响应面法优化超声提取工艺参数的方法可行且稳定。

3 结论

为了更好提取出大果木姜子中黄酮， 仅通过黄酮含量来评价，不足以代表提取工艺的优劣，因此采用多指标来评价能够更加客观综合的反映药材的最优提取工艺。 本试验以黄酮含量、 黄酮对DPPH 清除率为评价指标，超声功率、提取时间和液料比为考察因素， 采用总评归一-响应面法对超声提取工艺的参数进行优化， 得到最佳提取工艺参数为：提取时间35 min，超声功率60 W，液料比40：1（mL/g），得到的OD 值为0.9910，黄酮含量为2.48%， 该条件下对DPPH 自由基清除活性为93.18%。本研究为大果木姜子黄酮进一步研究开发提供了理论基础。