添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣全混合日粮发酵品质及有氧稳定性的影响

高巧仙， 朱万清， 李晓梅， 洪晓珍， 马润生， 脱征军， 辛国省

（1.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川 750021；2.宁夏饲料工程技术研究中心，宁夏银川 750021；3.宁夏回族自治区畜牧工作站，宁夏银川 750002）

宁夏酿酒葡萄种植面积达55 万亩， 占全国的1/4，年产葡萄酒近1.3 亿瓶，综合产值超过261 亿元。 葡萄酒酿造过程中，产生的葡萄皮渣约占葡萄加工量的20%～30%。 酿酒葡萄渣营养价值高，富含天然抗氧化剂（Yu 等，2013），可作为优质的粗饲料。但其水分含量高，难以长期保存，同时宁夏葡萄渣加工利用率低， 多数葡萄渣被抛弃或是直接饲喂。 受纤维素和单宁含量的影响，直接饲喂反刍动物不易消化，造成资源利用率不高和浪费严重。

酶和菌的使用是改善青贮饲料品质常用的方法， 合理地搭配使用能更好的的促进饲料原料发酵，从而提升饲料的品质和利用效果。纤维素酶能分解饲料中的纤维素、半纤维素和木质素，并能降解结构性糖类成为乳酸菌可利用的可溶性糖，增加乳酸的发酵底物，加速降低pH，提高青贮发酵品质 （李春霞，2010）。 布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）属异型发酵菌，能有效保存青贮饲料和提高其有氧稳定性（Kleinschmit，2006）。 目前对布氏乳杆菌和纤维素酶联合使用效果评价研究较少（刘辉等，2021）。 因此， 为合理利用酿酒葡萄渣资源，扩大饲料来源，克服酿酒葡萄渣季节性的时间

点，改善葡萄渣发酵全混合日粮品质，本试验研究添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣发酵全混合日粮发酵品质及有氧稳定性的影响，以期为生产优质的反刍动物葡萄渣发酵全混合日粮提供一定的理论依据和技术支撑，促进宁夏畜牧业更好发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料 酿酒葡萄渣购于宁夏西鸽酒庄有限公司，晾干粉碎添加，营养成分见表1；玉米秸秆由宁夏贺兰县祥鑫泰养殖合作社提供； 添加纤维素酶购于山东坤盛药业有限公司， 布氏乳杆菌购于西安米先尔生物科技有限公司， 活菌数为1.0×109cfu/mL。

表1 葡萄渣营养成分（风干基础）

1.2 FTMR 制备 采用完全随机单因素试验设计，在保持饲粮精粗比约为6：4（干物质基础）的前提下，酿酒葡萄渣添加水平为8%，配方按照25 kg育肥羊饲养标准配制。将不添加菌剂的对照组，纤维素酶按50、100 mg/kg，布氏乳杆菌按10、30 mg/kg，纤维素酶和布氏乳杆菌混合50×10 mg/kg、100×30 mg/kg 的添加量（添加量以全混合日粮（TMR）鲜重为基础， 接种方法是将每组所需菌粉和纤维素酶溶解至100 mL 无菌水中， 边用喷壶均匀喷洒边翻动青贮料）加入到预先混匀的精料中，分组装好待配TMR，TMR 组成及营养水平见表2。 将玉米秸秆揉切成2 ～3 cm， 按照试验设计将精料和粗料添加到TMR 搅拌车中混匀，通过添加适量水使搅拌均匀的TMR 含水率达到62%。 用“四分法”取制作好的TMR，装入1.5 L 发酵瓶中，压实密封存放在室内干燥地面上， 每个处理制备10瓶，每瓶净重1.5 kg。

表2 TMR 组成及营养水平%

1.3 样品采集 在TMR 饲料在发酵后的第45天打开发酵瓶，先对青贮饲料样品进行感官评定，然后按照4 分法采集样品。 取500 g 样品在105 ℃烘干测定水分，并粉碎过40 目筛，保存于封口塑料袋中，待测常规营养含量；取25 g 样品加100 mL蒸馏水， 榨汁机搅拌捣碎后用4 层纱布和定性滤纸过滤得浸出液， 所得浸出液一部分用于pH 测定，另一部分-20 ℃保存，用于发酵品质的测定；最后取500 g 样品用于测定有氧稳定性。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 感官评定 采用德国农业协会标准进行评价（张子仪，2000）。 青贮结束后，根据青贮饲料的气味、结构、色泽和发霉情况进行评价打分。 满分为20 分，16 ～20 分为一级优良，10 ～15 分为二级尚好，5 ～9 分为三级中等，0 ～4 分为四级腐败。

1.4.2 常规营养含量的测定 粗蛋白质含量参照GB/T 6432-1994， 粗灰分含量参照GB/T 6438-2007，中性洗涤纤维含量参照GB/T 20806-2006，酸性洗涤纤维含量参照NY/T 1459-2007，酸性洗涤木质素含量参照GB/T 20805-2006 测定。

1.4.3 发酵参数的测定 用pH 计测定滤液的pH； 氨态氮含量采用苯酚次氯酸钠比色法测定（冯宗慈等，2010）； 乳酸含量参照国标 GB/T 28377-2009 测定；乙酸、丙酸和丁酸含量参照郝建祥（2011）的方法采用安捷伦7820A 气相色谱仪进行测定。

1.4.4 有氧稳定性测定 青贮饲料开启后， 将剩余青贮饲料约500 g 混匀后置入1 L 聚乙烯罐中，插入温度记录仪（HOBO Pendant Coupler）探头，测定青贮饲料温度和环境温度，用青贮饲料温度与环境温度相差2 ℃时需要的时间来评定青贮饲料的有氧稳定性。

1.5 数据处理 采用Excel 2010 进行数据整理后，利用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析和显著性检验， 多重比较采用one-way ANOVA 中的Duncan’s 法进行统计分析，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 感官品质的影响 由表3 可知，各组青贮料样品均结构完整，直至发酵第45 天也未出现丁酸臭味或腐败味，总分等级在“尚好”以上。与对照组相比，纤维素酶处理组、布氏乳杆菌处理组和纤维素酶与布氏乳杆菌混合处理组的感官评定得分分别提高了21.43%、21.43%和28.57%，说明添加纤维素酶和布氏乳杆菌均能改善FTMR 的气味、色泽和质地。

表3 不同处理组的葡萄渣FTMR 感官评定

2.2 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 常规营养含量的影响 由表4 可知，添加纤维素酶和布氏乳杆菌对FTMR 的粗蛋白质和中性洗涤纤维影响显著（P＜0.05）。 Ⅱ组、Ⅳ组和Ⅴ组的粗蛋白质含量显著高于对照组（P＜0.05），分别提高了4.6%、6.6%、2.9%，但这三组差异不显著（P＞0.05）。 Ⅱ组的中性洗涤纤维含量显著低于对照组（P＜0.05），降低了4.92%。 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对FTMR 的酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、 粗灰分和有机物含量没有显著影响（P＞0.05）。

表4 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 常规养分含量的影响（干物质基础）%

2.3 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR发酵品质的影响 由表5 可知，添加纤维素酶和布氏乳杆菌对FTMR 的pH、 乳酸和丙酸影响显著（P＜0.05）。 添加布氏乳杆菌组、纤维素酶×布氏乳杆菌组的FTMR pH 均低于对照组，其中Ⅴ组的pH最低，为4.33；Ⅵ组次之，为4.34；Ⅳ组为4.39。 添加剂组的乳酸含量显著高于对照组， 分别提高了15.28%、20.07%、26.82%、22.56%、30.55%和29.31%。其中Ⅴ组最高，Ⅵ组次之。 Ⅵ组丙酸含量显著低于对照组，降低了26.92%。 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对FTMR 的乙酸没有显著影响（P＞0.05）。

表5 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 发酵品质的影响（干物质基础）

2.4 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 有氧稳定性的影响 添加纤维素酶和布氏乳杆菌可显著影响FTMR 有氧稳定性 （P＜0.05）。 添加剂组的有氧稳定性均高于对照组，其中Ⅲ组、 Ⅳ组和Ⅴ组有氧稳定时间分别提高了93.09%、122.07%、70.15%，且均在112 h 以上。

图1 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 有氧稳定性的影响

3 讨论

3.1 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 感官品质的影响 感官评分方法简便易行，结果直观，被广泛用于生产实践。 乳酸菌和纤维素酶能够提高青贮饲料的感官评分， 降低霉变率（钟书等，2017；崔彦召，2011；Ranjit 等，2002；Filya，2001；Driehuis 等，2001）。 席兴军等（2003）研究表明，乳酸菌组、纤维素酶组和乳酸菌与纤维素酶共同处理组的玉米秸秆青贮饲料感官评定得分分别比对照组高25%、42%和35%。本试验研究结果与以上结果一致， 发酵过程中各处理组均能够较好的保存45 d，均无霉变发生，纤维素酶组、布氏乳杆菌组、 纤维素酶与布氏乳杆菌混合组在色泽，气味和质地上要优于对照组。

3.2 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 常规营养指标的影响 粗蛋白质是饲料中含氮物质的总称， 对发酵饲料饲用价值的评判至关重要（崔彦召，2011）。布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，能将水溶性糖和乳酸分解产生乙酸、二氧化碳等。 高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代谢， 但是对于耐酸性能较好的布氏乳杆菌影响不大， 可快速成为青贮中的优势菌群， 减少发酵期间有害微生物繁殖代谢对营养物质的消耗，最大程度减少FTMR 蛋白质损失（刘辉等，2021）。这也是本试验中添加布氏乳杆菌FTMR 的粗蛋白质含量高于对照组的原因。 李斌等（2021）、朱妮等（2019）、钟书等（2017）研究发现， 添加纤维素酶可提高青贮饲料中粗蛋白质含量，本试验结果与其一致。 本试验中，添加纤维素酶组FTMR 的粗蛋白质含量显著高于对照组，且随着纤维素酶水平增加，FTMR 中粗蛋白质含量也显著增高， 这是由于纤维素酶可以水解植物的结构性碳水化合物，为青贮发酵提供底物，加快乳酸菌的生长繁殖，从而产生更多有机酸，降低pH，抑制植物酶活性及其他微生物生长， 从而减少蛋白质的消耗。

中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维是反映饲料中纤维质量好坏的重要指标。 本试验中添加布氏乳杆菌对中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素没有显著影响。 这与吕文龙等（2011）研究结果基本一致。纤维素酶可降解纤维素、半纤维素和木质素等动物不易消化的物质，并能水解细胞壁，释放内容物，增加乳酸的发酵底物，改善饲草青贮品质（张英等，2013；Al-Ghazzewi 等，2012）。 钟书等（2017）等研究发现，苜蓿青贮添加纤维素酶可有效降低其中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。本试验中， 添加纤维素酶可显著降低中性洗涤纤维含量， 而对酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量没有显著影响。 这与Sun 等（2009）研究结果一致，这可能与植物种类、生理状态、纤维素酶组成等多方面影响有关（吕文龙等，2011）。

3.3 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 发酵品质的影响 pH 是评价青贮发酵品质的重要指标之一， 其变化取决于青贮DM、化学成分和青贮周期。 优质青贮饲料pH 通常在4.2 以下，4.8 以上则认为发酵品质较差，4.2 ～4.8 为良好（马春晖等，2010）。 本试验中，各添加剂组pH 在4.33 ～4.47，其中布氏乳杆菌组和纤维素酶×布氏乳杆菌组pH 均显著低于对照组。且随着布氏乳杆菌量增加，FTMR 的pH 显著下降。 这与陆永祥等（2020）研究结果一致，添加布什乳杆菌可显著降低青贮的pH， 从而提高其发酵品质和有氧稳定性。

乳酸和挥发性脂肪酸含量是评价青贮质量好坏的重要指标。 布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，能将水溶性糖和乳酸分解产生乙酸、二氧化碳等，降低乳酸含量，产生更多的乙酸，布氏乳杆菌组和纤维素酶×布氏乳杆菌组均添加了布氏乳杆菌， 将酿酒葡萄渣中自然附带菌所产乳酸分解转化为乙酸， 使布氏乳杆菌组和纤维素酶×布氏乳杆菌组的乳酸和乙酸含量高与对照组。 而高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代谢， 但是对于耐酸性能较好的布氏乳杆菌影响不大，可快速成为青贮中的优势菌群，通过代谢进一步积累青贮中的有机酸， 可在短期内使青贮的pH 下降，缩短青贮从储存到进入稳定发酵期的时间，减少发酵期间不良代谢产物丙酸的积累，最大程度保存酿酒葡萄渣FTMR 中的各营养成分，提高发酵品质。

3.4 添加纤维素酶和布氏乳杆菌对葡萄渣FTMR 有氧稳定性的影响 有氧稳定性是青贮饲料一个重要的特性， 其决定了青贮饲料暴露在空气中的质量和安全性。 Nishino 等（2007）和Oude 等（1999）研究表明，布氏乳杆菌能提高青贮饲料有氧稳定性的机理在于将青贮发酵过程中产生的乳酸转变为乙酸和1，2-丙二醇。 乙酸具有抗真菌的作用， 能够有效提高青贮饲料暴露于空气后的有氧稳定性， 本试验研究与之相符，添加布氏乳杆菌组的乙酸均高于对照组，同时有氧稳定时间也长于对照组。 刘辉等（2021）和吕文龙等（2011）研究发现，布氏乳杆菌可提高青贮玉米秸秆pH 和乙酸含量，提高青贮玉米秸秆的有氧稳定性。 本试验中，纤维素酶×布氏乳杆菌组的有氧稳定时间低于布氏乳杆菌组，其机理还有待进一步研究。

4 结论

添加纤维素酶和布氏乳杆菌添加剂均能显著改善FTMR 感官品质和发酵品质。 添加布氏乳杆菌组的有氧稳定性较优，存放时间较长。