猪源乳酸片球菌的分离及体外生物学特性研究

武真邑， 秦士贞 ， 张董燕 ， 王四新， 季海峰， 史兆国

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097）

乳酸菌是动物肠道菌群的重要组成部分，其作用方式是产生有机酸降低肠道pH，产生抗菌物质及其他代谢产物抑制肠道有害菌生长繁殖（Pierina 等，2021；Pringsulaka 等，2015），最终通过影响肠道生理功能来对机体健康发挥有益作用（Hill 等，2014；Jiao 等，2014）。 研究表明，将乳酸菌制剂应用在猪生产中， 能够增加猪消化道中有益菌数量，改善肠道菌群组成，调控短链脂肪酸代谢及组成，以及提高饲料转化效率和生产性能，在增强机体免疫性能等方面也具有积极的促进作用（Peng 等，2020；Zhang 等，2016；Zhang 和Lee，2014）。 我国自2020 年7 月施行饲料全面禁抗以来， 乳酸菌制剂作为一种新型的饲料添加剂备受关注，然而，乳酸菌的菌株来源、菌株生长生理特点对其作用效果及产品研发都会产生影响。因此，分离筛选优良的乳酸菌菌株， 进行菌株益生特性方面的研究， 使其能够科学应用于我国实际养猪生产，有着广阔的应用前景。本研究室从猪粪便中分离得到一株乳酸片球菌，对菌株的生长性能、产乳酸、耐酸碱性能进行了研究，并对菌株的抑菌能力， 包括菌株抑制大肠杆菌生物膜形成及其抑制率、 抑菌效果以及相应的抗生素效价等方面进行了分析， 该研究结果为开发优良的猪源乳酸菌菌株提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 培养基 （1）MRS 液体培养基：酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、吐温-80 1 mL/L、硫酸锰0.05 g/L、硫酸镁0.2 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸三胺2 g/L、醋酸钠5 g/L、pH 7.5。 在MRS 液体培养基的基础上添加15 g/L琼脂，即为MRS 琼脂，121 ℃灭菌15 min。 （2）LB液体培养基：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L，121 ℃高压灭菌15 min。（3）TSB 肉汤：胰蛋白胨17 g/L、氯化钠5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、pH 7.3，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2 试验方法

1.2.1 猪源乳酸片球菌的分离与鉴定 新鲜猪粪样置于TSB 液体培养基中进行富集， 分别取0代、1 代、2 代菌培养液利用十倍稀释法涂板于MRS 琼脂中，放置于厌氧罐中37 ℃培养24 h，挑选单菌落进行纯化厌氧培养， 并对纯化菌种进行液体培养、20%甘油冻存。 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（试剂盒由天根生化科技有限公司提供） 提 取DNA，PCR 引 物 采 用27f （5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3' ）、1492r （5' -TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 进行16S 测序，将测序结果于NCBI blast 进行比对，并送至中国工业微生物菌种保藏管理中心进行生理生化特征和16S rDNA 鉴定。

1.2.2 生长曲线 将菌株18 h 活化后，接种量参考董婷（2014）的研究结果，按照0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%接种于MRS 液体培养基中， 采用Bioscreen C 生长曲线分析仪（购于上海谓载商贸发展有限公司， 产地芬兰） 测定其0 ～48 h 的OD600nm值， 绘制生长曲线。 根据生长曲线选取8、10、12、16、20、24 h 等时间点，吸取发酵液利用十倍稀释法涂板于MRS 固体培养基进行活菌数测定。

1.2.3 产乳酸性能 在上述时间点测定活菌数的同时，每个时间点取上清液1 mL，利用乳酸试剂盒（购于南京建成生物工程研究所）测定乳酸含量。

1.2.4 耐酸碱性能 将菌株18 h 活化后，分别接种到pH 为2、3、4、6、6.5、7、8、10 的MRS 液体培养基中，于37 ℃培养箱中培养0、2、4 h，测定其活菌数， 利用活菌数以及存活率分析菌株的耐酸碱性能。

1.2.5 乳酸片球菌对大肠杆菌抑制能力的测定将菌株按照上述研究所得最适培养时间进行活化，按照上述研究所得最适添加量添加至MRS 液体培养基中，从0 h 开始，每隔2 h 取1 mL 培养液至24 h。 参照舒中玉（2018）的研究方法，将乳酸片球菌发酵液用0.22 μm 无菌滤器进行过滤，利用牛津杯法测定不同时间培养基上清液对指示菌大肠杆菌C83905（Escherichia coliC83905）（购于中国兽医药品监察所）的抑菌圈直径，以此来判断其抑菌能力， 确定乳酸片球菌抑制大肠杆菌的最佳培养时间。

1.2.6 乳酸片球菌抑制大肠杆菌生物膜形成试验

1.2.6.1 大肠杆菌生物膜形成能力测定 指示菌为标准菌株大肠杆菌C83905， 根据吴丽娜等（2021）的研究方法并进行适当修改，将大肠杆菌C83905 菌液调整至1×106CFU/mL， 备用。 在12孔微孔板中加入900 μL MRS 液体培养基， 再加入100 μL 大肠杆菌C83905 菌液， 于37 ℃分别培养至6、12、18、24、30、36、42、48 h，用移液枪吸出孔内培养液，0.85% NaCl 冲洗3 ～4 次，除去孔内未黏附浮游菌。 用处理过的无菌刮刀将附着在12 孔板内大肠杆菌C83905 生物膜刮下，在12 孔板内加入1 mL 0.85%的NaCl，混匀之后利用十倍稀释法进行稀释，涂板于LB 固体培养基，进行菌落计数以此评估不同时间大肠杆菌C83905 的生物膜行成能力。

1.2.6.2 乳酸片球菌对大肠杆菌生物膜的抑制试验 根据1.2.6.1 结果中大肠杆菌C83905 生物膜的最佳形成时间，进行乳酸片球菌的抑菌试验。将乳酸片球菌发酵液用0.22 μm 无菌滤器过滤，根据吴丽娜等（2021）的研究方法并适当修改后将上清液浓度分别利用干净、无菌MRS 液体培养基稀释，使其浓度分别为原液，稀释2、4、8、16、32、64倍，吸取180 μL 加入到96 孔板中，再加入20 μL活菌浓度为1×106CFU/mL 的大肠杆菌C83905菌液，利用Bioscreen C 生长曲线分析仪，在37 ℃条件下测定乳酸片球菌对大肠杆菌C83905 生物膜形成的抑制能力，每组6 个重复。

同时，取上述乳酸片球菌原液，稀释2、4、8、16、32、64 倍，各吸取900 μL 加入12 孔板，再加入100 μL 的大肠杆菌 （1×106CFU/mL），37 ℃下培养12 h，用移液枪吸出孔内培养液，0.85% NaCl冲洗3 ～4 次，除去孔内未黏附浮游菌，然后用无菌刮刀将附着在12 孔板内大肠杆菌生物膜刮下，利用十倍稀释法涂板于LB 固体培养基， 利用菌落计数评估乳酸片球菌上清液对大肠杆菌C83905 的抑制率，每组6 个重复。

1.2.7 乳酸片球菌抑菌能力的抗生素效价分析选用四种抗生素：盐酸四环素、氨苄青霉素、硫酸庆大霉素以及链霉素硫酸盐（均由大连美仑生物技术有限公司提供）。参照王发明（2010）的方法并做出适当修改，测定其不同浓度的标准液（C）对致病菌大肠杆菌的抑菌圈直径 （mm）， 通过ELISAcalc 作图软件以抑菌圈直径为纵坐标、lgC为横坐标， 绘制出抗生素效价曲线（二次回归曲线）。 根据上述乳酸片球菌对大肠杆菌C83905 抑制能力的测定结果，带入二次回归曲线公式，利用最大抑菌圈直径求出相应的抗生素浓度。

1.3 数据处理 试验数据利用Excel 软件初步处理，再利用SPSS 23.0 对数据进行分析及处理，进行ANOVA 单因素方差分析，结果用“平均值±标准误”表示，且P＜0.05 代表差异显著。

2 结果

2.1 猪源乳酸片球菌的分离鉴定 本试验分离得到1 株乳酸片球菌，如图1 所示，菌株的菌落为乳白色、边缘整齐、圆形光滑不透明，经革兰氏染色法染色，在油镜下观察，如图2 所示，为革兰氏阳性菌，呈球状成群分布。经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus Lactis）， 本 实 验 室 编 号 为 ZLP025。

图1 菌落形态

图2 染色后菌体形态（1000×）

2.2 生长曲线测定 测定不同接种量条件下乳酸片球菌ZLP025 的生长曲线，由图3 可知，0 ～2 h 为菌株生长滞缓期，2 ～8 h 为菌株生长对数期，8 ～24 h 进入生长稳定期。 测定不同菌株添加量在不同时间的活菌数发现，如图4 所示，乳酸片球菌ZLP025 在添加量为2.5%且培养时间为第16 h 时，活菌数最高，为2.24×109CFU/mL，另外测定其生长pH 为3.87， 利用SPSS 23.0 对数据进行分析可知此时活菌数最高，pH 最低，但与其他数据相比差异不显著（P＞0.05）。 将该添加量和培养时间确定为后续试验活化菌种添加量和时间。

图3 生长曲线

图4 不同时间不同添加量活菌数

2.3 产乳酸性能 由图5 可知， 各添加量的乳酸含量在液体培养基中培养第8 h 时随添加量依次递增，随着培养时间的增加，在第16 h 时，乳酸含量在菌株添加量为2.5%时达到最高，为73.75 mmol/L。 随后随着时间的增加，乳酸含量有所下降。

图5 乳酸含量测定

2.4 耐酸碱性能 由图6 可知，当pH 为2 时，培养时间由0 ～2 h，活菌数有所降低，随着pH 增加为3、4、6、6.5、7、8、10 时，菌液中的活菌数均无下降趋势，说明菌株能够耐受pH 在3 ～10 的环境。且当pH 为6.5 时，相同时间培养下，活菌数最高，说明pH 为6.5 是菌株培养的最适pH，当pH 增加时，活菌数相对于pH 为6.5 时有所降低，当pH增加到10，其在0、2、4 h 时的活菌数下降，分别为3.95×107、4.28×107CFU/mL 和7.95×107CFU/mL。

图6 耐酸碱性能

2.5 乳酸片球菌对大肠杆菌抑制能力的测定由表1 可知，从0 h 开始，其上清液原液对大肠杆菌C83905 的抑菌圈直径为（8.0±0.34）mm，随着培养时间的增加，其抑菌圈直径相应增加，直至第14 h 时， 上清液原液对大肠杆菌C83905 的抑菌圈直径增加至（21.0±0.23）mm，至第16 h 时，抑菌圈直径增加为（28.0±0.45）mm，达到了最大值。 随后随着培养时间的增加，抑菌圈直径有所减小，第18 h 时，抑菌圈直径减小为（28.0±0.45）mm，至第24 h 时，抑菌圈直径减小为（18.5±0.29）mm。 通过SPSS 23.0 分析可得，16 h 时抑菌圈直径与其他时间相比差异均显著（P＜0.05）。

表1 不同时间上清液原液对大肠杆菌C83905 的抑菌圈直径mm

2.6 乳酸片球菌抑制大肠杆菌生物膜形成试验

2.6.1 大肠杆菌生物膜形成能力测定 由图7 可知， 当培养至12 h 时生物膜中大肠杆菌C83905活菌数最高，其活菌数为3.55×108CFU/mL。 随后随着时间增加至48 h，活菌数逐渐降低，因此，选用12 h 为大肠杆菌C83905 最佳成膜时间， 并进行后续试验。

图7 大肠杆菌生物膜中活菌数的测定

2.6.2 乳酸片球菌对大肠杆菌生物膜抑制率试验由图8 可知，上清液原液、稀释2 倍、稀释4 倍这三个浓度对大肠杆菌的抑制作用较强，随着时间的增加，OD600nm值无变化，从上清液稀释8 倍开始，各个浓度下OD600nm值均随着时间的增加有所增加，这表明上清液的最小抑菌稀释倍数为4 倍。

图8 对大肠杆菌生物膜抑制曲线

由图9、10 可知，当上清液稀释8 倍时，大肠杆菌仍有较高活菌数， 此时抑制率较低，为1.14%，随着抑菌浓度的增加，活菌数出现下降的趋势。 当上清液稀释4 倍时， 大肠杆菌活菌数为7.94×105CFU/mL，抑菌率为19.54%，当不对上清液进行稀释时，活菌数为0，抑菌率为100%，表明此时大肠杆菌全部被抑制，无法生长。

图9 大肠杆菌生物膜形成的抑制

图10 对大肠杆菌抑制率

表2上清液相对于抗生素效价

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2.7 猪源乳酸片球菌相应的抗生素效价分析四种抗生素对大肠杆菌效价曲线如图11、12、13、14 所示， 上清液相对于抗生素效价如表2 所示。随着培养时间的增加， 上清液原液对大肠杆菌的抑制能力也相应增加，培养至16 h 时，抑菌圈直径达到最大值28 mm，随后随着时间的增加，抑菌圈直径逐步减小。 将上清液抑菌最大抑菌圈带入相应的抗生素效价计算公式中可知， 猪源乳酸片球菌ZLP025 培养16 h， 其上清液抑菌效果相应的抗生素效价分别为：盐酸四环素1.01 mg/mL、氨苄青霉素1.08 mg/mL、 硫酸庆大霉素97.54 mg/mL及链霉素硫酸盐1.26 mg/mL。

图11 盐酸四环素对大肠杆菌效价曲线

图12 氨苄青霉素对大肠杆菌效价曲线

3 讨论

乳酸片球菌（Pediococcus lactis）属于片球菌属，兼性厌氧。目前在人粪便、酸白菜、酸马奶及发酵香肠中都已分离得到。有研究表明，乳酸片球菌能够产生有机酸、环二肽、细菌素等，可在食品中作为生物防腐剂使用（Kaur 等，2014）。 本文从猪粪便中分离得到一株乳酸片球菌， 该菌在2 h 的滞缓期之后，便进入对数生长期，菌株生长迅速，说明该菌株具有在肠道中快速繁殖的能力， 这与舒中玉（2018）研究结果一致，说明菌株有可能迅速繁殖成为肠道内优势菌群。 8 h 末，菌株进入稳定期，其OD600nm值稳定下来。 张博文等（2021）报道的猪源乳酸片球菌L9 其2 ～8 h 也是对数生长期，8 h 后进入生长稳定期，本试验结果与其一致，但本试验中乳酸片球菌ZLP025 生长最佳pH为3.87，低于张博文等（2021）报道的L9 菌株（pH最低为4.42），这说明本试验分离的猪源乳酸片球菌产酸性能更佳。另外，黄沧海等（2004）研究仔猪源罗伊氏乳杆菌发现， 通过在培养过程中适时补充营养物质后， 菌株的的对数生长期能从第2 h延长至22 h 结束，其对数生长期维持了20 h。 因此，可以依据这些结果，适时对猪源乳酸片球菌进行营养物质补充，以延长对数生长期，提高菌体密度，为科研和生产提供较高浓度的活性菌体。

图13 硫酸庆大霉素对大肠杆菌效价曲线

图14 链霉素硫酸盐对大肠杆菌效价曲线

微生物制剂需要有一定的耐酸能力才能够通过胃内环境，到达肠道，发挥益生作用，猪胃液pH在2.0 ～4.5，一般保持在3.0，食物通过胃需要2～3 h。王津等（2014）研究表明，3 株母猪源乳酸片球菌在pH 为2.5 处理3 h 后存活率分别为34.90%、32.93%、28.76%。 本次试验结果表明，在pH 为2 的酸性环境中， 菌株在2 h 的存活率为71.78%，在pH 为3 的酸性环境中，菌株在2、4 h的存活率分别为99.89%和99.72%，在pH 为4 的酸性环境中， 菌株2、4 h 的存活率分别为100.93%和104.74%，说明本试验分离得到的猪源乳酸片球菌耐酸性能更强， 能够耐受动物的胃部酸性环境。另外，乳酸菌能够在其生长过程中产生乳酸（Wang 等，2020），应用于动物生产中能够有效降低肠道pH 和氧化还原电势， 抑制有害微生物的生长（Nagpal 等，2012）。 本试验测定了猪源乳酸片球菌ZLP025 产乳酸情况，结果发现，该菌株在添加量为2.5%培养时间为16 h 时， 乳酸含量最高，为73.75 mmol/L，这要高于李洁等（2014）报道的8 株乳酸片球菌发酵液乳酸产量， 李洁等（2014）还指出，改变碳源会影响菌株的乳酸产量，由此可见， 本试验菌株ZLP025 在产乳酸性能方面仍有优良的开发潜力。

研究表明， 抗生素能够有效抑制致病菌（Teh和Lee 和Dykes，2019；Kaplan 等，2011）， 四环素类药物能够抑制细菌蛋白质的合成起到杀菌作用， 属于高效杀菌剂 （韩景华，2020；Kang 等，2018）， 氨苄青霉素可利用结合蛋白与酶相互作用，影响细胞壁的合成，导致细菌死亡（Maciej 等，2019），硫酸庆大霉素和链霉素能够与细菌核糖体的30 s 亚单位结合，抑制细菌蛋白质合成，以此来抑制细菌生长。 但抗生素的诸多弊端直接影响到畜禽健康、 产品安全及人类健康 （Sazykin 等，2021），在我国当前饲料全面禁抗的背景下，具有抑菌作用的益生菌有望成为抗生素替代品（Nuria等，2019）。 大肠杆菌是一种常见的致病菌（Sommers 等，2018），在养猪生产中是造成猪腹泻的主要原因（Jean-félix 等，2017），陈亚男等（2020）、舒中玉（2018）、王娟（2016）等利用牛津杯法研究乳酸片球菌对大肠杆菌的抑制作用发现，乳酸片球菌抑菌圈直径分别达到了20.0、15.0 mm 和15.56 mm。本试验利用牛津杯法研究发现， 乳酸片球菌ZLP025 对大肠杆菌C83905 的抑菌圈直径最高可达28.0 mm，数值大于辛在海和王国雷（2011）研究的乳酸片球菌PA003 对大肠杆菌的抑菌圈（13.97 mm），以及陈亚男等（2020）（15.0 mm）、舒中玉（2018）（15.56 mm）、王娟等（2016）（20.0 mm）研究乳酸片球菌对大肠杆菌抑菌圈直径， 说明本菌株抑菌性能较为优越。

细菌生物膜具有较高耐药性、 极强黏附性及抗吞噬性， 生物膜的形成能够发生多种细菌感染性疾病， 是细菌感染主要根源之一 （张珊珊等，2021）。 研究表明，大肠杆菌等致病菌通过形成复杂的生物膜而定植于肠道内（吴丽娜等，2019）。本试验对乳酸片球菌抑制大肠杆菌生物膜进行了试验，结果发现，乳酸片球菌上清液稀释4 倍，能够抑制大肠杆菌生物膜形成， 且对大肠杆菌活菌抑制率为19.54%，上清液原液培养时，对大肠杆菌抑菌率能达到100%。 抗生素效价的测定标准以其抑菌能力或杀菌能力来衡量（辛在海和王国雷，2011），王发明（2010）利用大肠杆菌作为指示菌研究了植物乳杆菌上清液对多黏菌素B 的效价试验。 本试验利用大肠杆菌C83905 作为指示菌，研究了乳酸片球菌上清液相对于多种抗生素效价，结果发现，乳酸片球菌ZLP025 上清液相对于盐酸四环素、氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、链霉素硫酸盐等四种抗生素的效价分别为1.01、1.08、97.54、1.26 mg/mL。 本试验选用盐酸四环素、氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、 链霉素硫酸盐等作为参考抗生素，测定乳酸片球菌相对抑菌效价的方法，为乳酸片球菌的抑菌活性测定以及比较提供了定量方法。

4 结论

本试验分离得到的猪源乳酸片球菌ZLP025，在培养16 h 时生长性能最佳， 其活菌数为2.24×109CFU/mL，pH 为3.87， 产乳酸含量为73.75mmol/L，对猪源大肠杆菌抑菌直径达28 mm。 进一步研究发现，乳酸片球菌ZLP025 发酵上清液能有效抑制猪源大肠杆菌生物膜形成， 其抑菌效价分别可达到对盐酸四环素1.01 mg/mL、氨苄青霉素1.08 mg/mL、硫酸庆大霉素97.54 mg/mL 及链霉素硫酸盐1.26 mg/mL。 这些结果表明， 猪源乳酸片球菌ZLP025 能够作为优良乳酸菌发挥益生作用，并具有良好的应用开发潜力。