香蕉皮总黄酮的提取及其抗氧化和抑制酪氨酸酶的活性

彭思琪，王娟*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.广东省香蕉精深加工与综合利用工程技术研究中心，广东 广州 510641）

香蕉广泛种植于热带地区[1]，是世界上广泛食用的第二大重要水果作物[2-3]。我国为香蕉生产大国，2019年香蕉产量达1 165.6万吨[4]。香蕉皮作为香蕉食用和加工过程中的主要副产物，占香蕉果实总质量的30%～40%[5]。香蕉皮含有丰富的果胶、酚类化合物、纤维、矿物质、糖类[6-8]及黄酮类化合物[9]等营养物质，具有较高的利用价值，其中，香蕉皮中总黄酮含量随香蕉品种、成熟度等条件的变化而发生变化。但目前，香蕉皮被作为废弃物[10]，未得到充分利用。

目前，对于香蕉皮总黄酮的提取工艺优化、抗氧化性及抗菌活性等方面已有较多研究。Ishak等[11]、Hernández-Carranza等[12]分别采用超声辅助提取和搅拌提取方法提取香蕉皮总黄酮，并证明了香蕉皮总黄酮具有DPPH、ABTS+自由基清除能力及Fe3+还原能力，但对于香蕉皮总黄酮抑制酪氨酸酶活性的研究较少。

细胞中的酪氨酸经催化氧化形成黑色素，酪氨酸酶在该过程中起到至关重要的作用，因此可通过抑制酪氨酸酶的活性抑制黑色素的形成[13]。目前，具有抑制酪氨酸酶活性的化学物质（如对苯二酚、曲酸等）可能会对皮肤产生刺激、引发接触性皮炎等，使用过程中可能存在副作用[14]。因此，植物天然成分对酪氨酸酶的抑制作用逐渐受到研究者们的关注。黄酮类化合物主要通过氢键作用和酪氨酸酶结合，改变酶构象结构，从而达到抑制酶催化活性的作用[15]。朱丹等[16]、吴颖等[17]分别发现橘黄酮粗提物、蒲公英黄酮具有抑制酪氨酸酶的活性，具有潜在抑制黑色素生成的功效。

基于此，本文在优化香蕉皮总黄酮提取工艺的基础上，探究香蕉皮总黄酮的抗氧化和抑制酪氨酸酶的活性，为综合利用香蕉皮提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香蕉：市售；九水合硝酸铝（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；芦丁标准品（色谱纯，≥98%）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、L-多巴（均为分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、30%过氧化氢（均为分析纯）：广州化学试剂厂；硫酸亚铁（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；醋酸钾、水杨酸、三氯化铁（均为分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；亚硝酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸（均为分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；L-酪氨酸（分析纯）：上海伯奥生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见光分光光度计（UV-1800）：日本岛津公司；旋转蒸发仪（RE-52A）：上海亚荣生化仪器厂；超声清洗机（KQ-300DE）：昆山市超声仪器有限公司；高速冷冻离心机（JW-3021HR）：安徽嘉文仪器装备有限公司；恒温振荡器（SHA-B）：常州澳华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理及香蕉皮颗粒的制备

香蕉成熟度评价参照参考文献[18]中的方法，本试验中香蕉的2种成熟度分别为成熟度1级（香蕉皮全绿）和成熟度6级（香蕉皮全黄，无明显黑斑）。将香蕉皮清洗干净，切去两端，并将其切成大小均匀的1 cm2的块状，液氮速冻后使用破壁机进行粉碎，得到香蕉皮颗粒，样品置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.2 香蕉皮总黄酮提取工艺

参照王亚君[19]的方法，稍作改动。取香蕉皮颗粒3 g，以一定的料液比、乙醇浓度、温度和超声时间进行超声辅助提取，将提取液转移至50 mL离心管中，在4 500 r/min下离心10 min，通过旋转蒸发进行浓缩，使用无水乙醇将浓缩后的溶液补足至30 mL，得到香蕉皮总黄酮样品溶液，于4℃保存备用。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 料液比对香蕉皮总黄酮得率的影响

固定乙醇浓度60%、温度60℃、超声时间60 min、超声功率为 300 W，分别在料液比为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的条件下进行提取，考察料液比对香蕉皮总黄酮得率的影响。

1.3.3.2 乙醇浓度对香蕉皮总黄酮得率的影响

固定料液比 1∶25（g/mL）、温度 60 ℃、超声时间60 min、超声功率为300 W，分别在乙醇浓度为60%、70%、80%、90%、95%、100%的条件下进行提取，考察乙醇浓度对香蕉皮总黄酮得率的影响。

1.3.3.3 温度对香蕉皮总黄酮得率的影响

固定料液比 1∶25（g/mL）、乙醇浓度 95%、超声时间60 min、超声功率为300 W，分别在温度为30、40、50、60、70℃的条件下进行提取，考察温度对香蕉皮总黄酮得率的影响。

1.3.3.4 超声时间对香蕉皮总黄酮得率的影响

固定料液比 1∶25（g/mL）、乙醇浓度 95%、温度60℃、超声功率为300 W，分别在超声时间为20、30、40、50、60、70 min的条件下进行提取，考察超声时间对香蕉皮总黄酮得率的影响。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验的结果，以香蕉皮总黄酮得率为指标进行正交试验，正交试验的因素和水平见表1。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 香蕉皮总黄酮得率的计算

香蕉皮总黄酮含量的测定方法参照SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》[20]。在波长420 nm处测定吸光值，用30%乙醇溶液作为空白对照，以吸光值（Y）对质量浓度（X，mg/mL）作图，得到芦丁的标准曲线。精密吸取待测样品溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，香蕉皮总黄酮得率计算公式如下。

式中：W为香蕉皮总黄酮得率，%；c为根据吸光值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D为溶液稀释倍数；V为供试品溶液体积，mL；m为香蕉皮质量，g。

1.3.6 香蕉皮总黄酮的抗氧化活性测定

1.3.6.1 羟自由基清除能力测定

参照Hou等[21]的方法，稍作改动。样液于37℃水浴1 h，在510 nm波长处测定吸光值，羟自由基清除率计算公式如下。

式中：A0为H2O2溶液+95%乙醇的吸光值；A1为香蕉皮总黄酮溶液+H2O2的吸光值；A2为香蕉皮总黄酮溶液+蒸馏水的吸光值。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力测定

参照Floegel等[22]的方法，稍作改动。样液振摇均匀，室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值，DPPH自由基清除率计算公式如下。

式中：A0为DPPH溶液+95%乙醇的吸光值；A1为香蕉皮总黄酮溶液+DPPH溶液的吸光值；A2为香蕉皮总黄酮溶液+无水乙醇的吸光值。

1.3.6.3 Fe3+还原能力测定

参考王梅霖等[23]的方法，稍作改动。取2 mL香蕉皮总黄酮溶液于试管中，加入2.5 mL 1%铁氰化钾溶液和2.5 mL pH7.2磷酸盐缓冲溶液（phosphatebuffersaline，PBS），混匀后 40 ℃水浴 20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于6 000 r/min离心10min，取1 mL上清液与6 mL蒸馏水混匀，加入0.2 mL 0.1%的三氯化铁溶液，于波长700 nm处测定吸光值。

1.3.6.4 ABTS+自由基清除能力测定

参照Re等[24]的方法，稍作改动。样液在室温下避光反应4min，于734nm处测定吸光值，ABTS+自由基清除率计算公式如下。

式中：A0为ABTS溶液+95%乙醇的吸光值；A1为香蕉皮总黄酮溶液+ABTS溶液的吸光值；A2为香蕉皮总黄酮溶液+无水乙醇的吸光值。

所有抗氧化试验中，均以VC为阳性对照进行试验。

1.3.7 抑制酪氨酸酶活性测定

香蕉皮总黄酮和曲酸抑制酪氨酸酶活性试验各反应体系试剂加入量见表2。

表2 抑制酪氨酸酶活性试验试剂加入量Table 2 Addition amounts of reagents in tyrosinase inhibition test

参照范敬宜[25]的方法，稍作改动。根据表2中C1、C2、C3、C4反应体系准确吸取相应溶液并进行加样，先向试管中加入香蕉皮总黄酮或者曲酸溶液、L-酪氨酸溶液（酪氨酸酶起到单酚酶作用）或者L-多巴溶液（酪氨酸酶起到二酚酶作用）和PBS（pH6.8），置于37℃中水浴10 min，向混合溶液中加入酪氨酸酶溶液，置于37℃下水浴14 min，迅速移入比色皿中，于475 nm处分别测定反应体系C1、C2、C3、C4的吸光值AC1、AC2、AC3和 AC4，以曲酸为阳性对照，酪氨酸酶抑制

1.4 数据处理

所有试验均重复测定3次，数据表示为平均值±标准差。利用Origin 9.1作图，采用SPSS Statistics 22进行显著性分析和方差分析，P＜0.05表示差异显著。率的计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对香蕉皮总黄酮得率的影响

料液比对香蕉皮总黄酮得率的影响见图1。

图1 料液比对香蕉皮总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids from banana peels

由图1可知，香蕉皮总黄酮得率随溶剂体积的增大呈现先上升后下降的趋势。其中，料液比为1∶25（g/mL）时总黄酮得率最高（P<0.05），这可能是由于溶剂体积增加使黄酮类物质溶出更加充分[26]，总黄酮得率增加。溶剂过多时，大量的乙醇溶剂会吸收一部分超声能量，从而减少超声能量对原料的作用，妨碍总黄酮的溶出，同时，杂质的溶出也会使总黄酮溶解度降低[26]，导致香蕉皮总黄酮得率下降。故选用料液比1∶25（g/mL）为中心水平进行后续的优化试验。

2.1.2 乙醇浓度对香蕉皮总黄酮得率的影响

乙醇浓度对香蕉皮总黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对香蕉皮总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from banana peels

由图2可知，香蕉皮总黄酮得率随乙醇浓度增加呈现先上升后下降的趋势。当乙醇浓度为95%时总黄酮得率最高（P<0.05），这可能是由于黄酮类化合物的极性与95%乙醇接近[27]，利于香蕉皮总黄酮的溶出，但乙醇浓度过高可能会产生较大的渗透压[28]，从而降低香蕉皮总黄酮得率。故选用乙醇浓度95%为中心水平进行后续的优化试验。

2.1.3 温度对香蕉皮总黄酮得率的影响

温度对香蕉皮总黄酮得率的影响见图3。

图3 温度对香蕉皮总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of temperature on the yield of total flavonoids from banana peels

由图3可知，香蕉皮总黄酮得率随温度增加呈现先上升后下降的趋势。其中，温度为60℃时总黄酮得率最高（P<0.05），这可能是因为温度升高，乙醇黏度减小[29]，利于香蕉皮总黄酮的溶出，但过高的温度会导致乙醇溶液挥发，料液比增大，杂质溶出量增加[29]，同时，高温可能会导致黄酮类化合物分子结构遭到破坏[28]，使香蕉皮总黄酮得率减小。故选用温度60℃为中心水平进行后续的优化试验。

2.1.4 超声时间对香蕉皮总黄酮得率的影响

超声时间对香蕉皮总黄酮得率的影响见图4。

图4 超声时间对香蕉皮总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from banana peels

由图4可知，香蕉皮总黄酮得率随超声时间的增加呈现先上升后下降的趋势。其中，超声时间为50min时总黄酮得率最高（P<0.05），这可能是由于大多黄酮类化合物存在于细胞中，超声波破坏细胞结构[30]，使香蕉皮总黄酮不断溶出，但超声时间过长可能会破坏黄酮类化合物分子结构[30]，导致香蕉皮总黄酮得率下降。故选用超声时间50 min为中心水平进行后续的优化试验。

2.2 正交试验结果

以香蕉皮总黄酮提取得率为评价指标，选取料液比、乙醇浓度、温度、超声时间进行四因素三水平正交试验设计，正交试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Table 4 Results of analysis of variance

根据表3可知，影响香蕉皮总黄酮得率的因素主次顺序为 B（乙醇浓度）＞D（超声时间）＞A（料液比）＞C（温度），香蕉皮总黄酮的最佳提取条件组合为A1B2C2D2，即料液比为 1∶20（g/mL），乙醇浓度为 95%，温度为60℃，超声时间为50 min，与正交试验中2号组合的总黄酮得率最高是一致的。根据表4可知，料液比、乙醇浓度、温度和超声时间对香蕉皮总黄酮提取得率都有极显著影响。

2.3 验证试验

根据2.2中优化的提取条件进行验证性试验，重复3次，得到香蕉皮总黄酮平均得率为1.82%，相对标准偏差为0.15%，表明该提取工艺重复性良好，适合于香蕉皮总黄酮的提取。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 羟自由基清除率

香蕉皮总黄酮和VC对羟自由基的清除作用见图5。

图5 香蕉皮总黄酮和VC对羟自由基的清除作用Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由图5可知，试验考察浓度范围内，香蕉皮总黄酮和VC对羟自由基的清除率随其浓度的增大而逐渐提高，其对羟自由基的清除能力大小顺序为成熟度6级香蕉皮总黄酮＞成熟度1级香蕉皮总黄酮＞VC，且具有显著性差异（P＜0.05），成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮、VC清除羟自由基的IC50值分别为0.12、0.09、15.06 mg/mL，表明香蕉皮总黄酮具有较强的羟自由基清除能力，与张兆英等[31]的研究一致。

2.4.2 DPPH自由基清除率

香蕉皮总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用见图6。

图6 香蕉皮总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由图6可知，试验考察浓度范围内，香蕉皮总黄酮和VC对DPPH自由基的清除率随其浓度的增大而提高，在较低浓度（0.15 mg/mL）下，香蕉皮总黄酮和VC对DPPH自由基清除率差异显著（P＜0.05），其大小顺序为成熟度6级香蕉皮总黄酮＞成熟度1级香蕉皮总黄酮＞VC，而在较高浓度（0.35 mg/mL）下，其 DPPH 自由基清除率没有显著差异，成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮、VC清除DPPH自由基的IC50值分别为0.09、0.04、0.14 mg/mL，表明香蕉皮总黄酮具有较强的DPPH自由基清除能力。Hernández-Carranza等[12]以水溶性维生素E为阳性对照，研究得到香蕉皮总黄酮具有较强的清除DPPH自由基的能力，与本试验结果一致。

2.4.3 Fe3+还原能力测定

香蕉皮总黄酮和VC对Fe3+的还原能力见图7。

图7 香蕉皮总黄酮和VC对Fe3+的还原能力Fig.7 Fe3+reduction abilities of total flavonoids from banana peels and VC

抗氧化剂的还原性越强，抗氧化能力越强，利用抗氧化剂可将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+与FeCl3反应，生成普鲁士蓝，普鲁士蓝在700 nm波长处具有最大吸光值的原理，对抗氧化剂的Fe3+还原能力进行测定，吸光值越大，说明抗氧化剂的抗氧化性越强[23]。由图7可知，试验浓度范围内，香蕉皮总黄酮和VC对Fe3+的还原能力随其浓度的增大而提高，在每个试验浓度下，其对Fe3+还原能力的大小为成熟度1级香蕉皮总黄酮＞成熟度6级香蕉皮总黄酮＞VC，且均具有显著性差异（P＜0.05），表明香蕉皮总黄酮具有较强的Fe3+还原能力，与顾采琴等[32]的研究结果一致。

2.4.4 ABTS+自由基清除率

香蕉皮总黄酮和VC对ABTS+自由基的清除作用见图8。

图8 香蕉皮总黄酮和VC对ABTS+自由基的清除作用Fig.8 ABTS+radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由图8可知，试验浓度范围内，香蕉皮总黄酮和VC对ABTS+自由基的清除率随其浓度的增大而提高，在每个试验浓度下，香蕉皮总黄酮的ABTS+自由基清除能力均显著高于 VC（P＜0.05）；样品浓度为 0.055 mg/mL～0.115 mg/mL时，2种成熟度香蕉皮总黄酮的ABTS+自由基清除能力没有显著差异，样品浓度上升至0.135 mg/mL时，成熟度1级香蕉皮总黄酮的ABTS+自由基清除能力显著高于成熟度6级香蕉皮总黄酮（P＜0.05），成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮、VC清除ABTS+自由基的 IC50值分别为 0.14、0.14、0.29 mg/mL，表明香蕉皮总黄酮具有较强的ABTS+自由基清除能力。Ishak等[11]研究表明，香蕉皮总黄酮的ABTS+自由基清除率可达84.7%，表明其具有较强的清除ABTS+自由基的能力，与本试验结果一致。

2.5 抑制酪氨酸酶活性试验

2.5.1 抑制酪氨酸酶单酚酶活性

香蕉皮总黄酮和曲酸抑制酪氨酸酶单酚酶活性试验结果如图9和图10所示。

图9 香蕉皮总黄酮和曲酸对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effects of total flavonoids from banana peels and kojic acid on monophenolase activity of tyrosinase

图10 香蕉皮总黄酮对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用Fig.10 Inhibitory effect of total flavonoids from banana peels on monophenolase activity of tyrosinase

由图9可知，香蕉皮总黄酮和曲酸对酪氨酸酶单酚酶的抑制率随其浓度的增加而提高。成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮、曲酸抑制单酚酶活性的IC50值分别为0.10、0.03、0.01 mg/mL，曲酸抑制酪氨酸酶单酚酶的活性显著高于香蕉皮总黄酮（P<0.05），而由图10可知，当香蕉皮总黄酮浓度增大至0.175 mg/mL时，成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮对单酚酶的抑制率可分别达到69.10%、75.35%。综上，香蕉皮总黄酮对单酚酶的抑制作用虽然显著低于曲酸，但在较高浓度下对单酚酶仍具有一定的抑制作用。

2.5.2 抑制酪氨酸酶二酚酶活性

香蕉皮总黄酮和曲酸抑制酪氨酸酶二酚酶活性试验结果如图11所示。

图11 香蕉皮总黄酮和曲酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用Fig.11 Inhibitory effects of total flavonoids from banana peels and kojic acid on diphenolase activity of tyrosinase

由图11可知，香蕉皮总黄酮和曲酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制率随其浓度的增加而提高，成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮、曲酸抑制二酚酶的IC50值分别为0.15、0.14、0.11 mg/mL，成熟度1级香蕉皮总黄酮对二酚酶的抑制作用显著低于曲酸（P<0.05），但成熟度6级香蕉皮总黄酮对二酚酶的抑制作用与曲酸基本没有显著性差异，在浓度为0.175 mg/mL时，成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮对二酚酶的抑制率分别为曲酸的87.91%、91.87%。结果表明，香蕉皮总黄酮对二酚酶的抑制作用虽然不及曲酸，但仍表现出较强的抑制二酚酶的活性。

3 结论

单因素试验和正交试验结果表明，香蕉皮总黄酮提取的最佳条件为料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度95%、温度60℃、超声时间50min，此时，总黄酮得率为1.82%。抗氧化试验结果表明，同浓度下，香蕉皮总黄酮的羟自由基、ABTS+自由基清除能力及Fe3+还原能力均显著强于VC；成熟度6级香蕉皮总黄酮对羟自由基的清除能力均显著高于成熟度1级香蕉皮总黄酮，而成熟度1级香蕉皮总黄酮的Fe3+还原能力均显著高于成熟度6级香蕉皮总黄酮。抑制酶活试验结果表明，香蕉皮总黄酮对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均具有一定的抑制作用，其中，浓度为0.175 mg/mL时，成熟度1级、成熟度6级香蕉皮总黄酮对二酚酶的抑制率分别相当于同浓度下曲酸抑制率的87.91%、91.87%。因此，香蕉皮总黄酮具有较强的抗氧化活性和一定的抑制酪氨酸酶的活性，在食品等领域具有潜在的开发应用价值。