低氧条件下HIF-1α 与VEGF 在宫颈癌Hela 细胞中的表达

苗丽娟 武梅 孙礼 王剑 毛宝宏 武美丽 姚婷婷 王晓霞 刘青

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050

宫颈癌是最常见的妇科癌症之一，近年来，发病率和死亡率逐年上升，引起全球关注［1-2］。宫颈癌发病的因素较多，近年来一些研究表明，低氧微环境对癌症的发生发展有重要影响，低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor、HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为已被证明在癌症发生历程中有直接影响的重要转录因子，在宫颈癌形成阶段的作用是一个值得被研究的领域［3-5］。本研究通过三气培养箱模拟缺氧条件下对人宫颈癌Hela 细胞进行体外培养，探究低氧条件下HIF-1α 和VEGF 在宫颈癌细胞中的转录变化规律，探讨宫颈癌治疗和改善预后的新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人宫颈癌Hela 细胞（甘肃省动物细胞创新中心）；HIF-1α 多克隆抗体；VEGF 多克隆抗体；Cy3-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（北京博奥森生物技术有限公司）；DMEM 高糖细胞培养液（兰州百灵生物技术有限公司）；新生牛血清NBS；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）；Normal Goat Serum（原液）（兰州民海生物工程有限公司）；4%多聚甲醛；DAPI solution（ready-to-use）（北京索莱宝生物科技有限公司）。

1.2 细胞培养 复苏人宫颈癌Hela 细胞，在37℃、5%CO2、饱和湿度的普通培养箱中培养，待细胞单层融合率约为80%且形态正常、长势良好时传代，分为低氧培养组与常氧培养组两组。

1.3 细胞低氧及常氧培养环境的建立 常氧：普通培养箱设置条件为37℃，CO2浓度5%、O2浓度21%。低氧：低氧培养箱设置条件为37℃，CO2浓度5%、O2浓度5%。

1.4 细胞爬片 常氧和低氧两组细胞分别通过胰蛋白酶消化法消化、离心，制成细胞悬液，均匀铺于6 孔板中爬片，并分别在相应条件下继续培养48h，待细胞单层融合率约80%～90%时用4%多聚甲醛固定。

1.5 免疫荧光染色 固定完成的细胞爬片用PBS 溶液清洗后加入0.5%Triton X100 通透液，室温通透15～20min；待细胞膜通透完成后再次用PBS 浸洗3 次并吸干多余液体，加入提前用原液稀释的Normal GoatSerum，在室温条件下封闭30min；30min 后用滤纸吸去封闭液，分别加入稀释好的一抗HIF-1α 和VEGF（稀释比例1 ∶300），在4℃冰箱中孵育12h。一抗孵育完成后洗脱杂质，滴入适量荧光二抗，37℃孵育2h 后在避光环境下用DAPI 染液将细胞核复染，洗脱杂质后封片以备观察。利用荧光显微成像系统采集实验结果图片，控制曝光时间和激发光电压等参数条件相同。

1.6 数据分析 使用数据分析软件Image pro plus6.0对荧光强度进行测量，Graphpad Prism 8 对实验结果进行统计学分析，每组结果选取5 个随机视野进行测量。t 检验进行统计分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF 的表达情况 细胞核与细胞浆中均存在VEGF 阳性表达。见图1。使用图片处理软件对比分析发现：低氧培养条件下VEGF 在Hela 细胞中所展现的荧光强度值高于常氧培养组，差异具有统计学意义（P＜0.001）。见图2、表1。

表1 VEGF 荧光强度检测结果

图1 VEGF 荧光染色结果

图2 VEGF 荧光强度检测结果

2.2 HIF-1α 的表达情况 细胞核中存在HIF-1α 大量阳性表达。见图3。使用图片处理软件对比分析发现：低氧培养条件下HIF-1α 在Hela 细胞中所展现的荧光强度值高于常氧培养组，低氧培养组的细胞中HIF-1α 荧光强度与常氧培养组中相比，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图4、表2。

表2 HIF-1α 荧光强度检测结果

图3 HIF-1α 荧光染色结果

图4 HIF-1α 荧光强度检测结果

3 讨论

宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，在国际癌症研究机构提供的全球2018 癌症发病率和死亡率统计中，宫颈癌的发病率和死亡率均排在第四位［6］。造成宫颈癌患者死亡的大多数原因是肿瘤的侵袭和转移。目前已经有大量研究证实HIF-1α 及VEGF 在宫颈癌Hela 细胞中高表达，研究［7］表明，在肿瘤细胞中HIF-1α 和VEGF 的高表达预示着更高的侵袭性和增殖性。

缺氧通常贯穿癌症病程的始终，诱导细胞代谢过程中适应性改变，包括从氧化磷酸化到糖酵解的转变，增加糖原合成，以及从葡萄糖到谷氨酰胺的开关作为脂肪酸合成的主要基材。这类广泛的代谢变化由HIF-1α的表达水平协调以平衡供氧和需求［8］。HIF-1α 是肿瘤细胞适应缺氧而产生的一种核转录因子。在缺氧微环境下能够激活其转录活性，使肿瘤的一些生物学特性改变，这些生物学特性包括肿瘤的侵袭、转移以及肿瘤血管的形成等［9］。HIF-1α 也伴随肿瘤的抑制剂（如VHL）功能和致癌因子增益损失，导致（PI3K / AKT /MTOR）活性在癌细胞内被激活，并介导癌症发展和抗治疗的代谢改变［4］。大量研究证实，VEGF 在多种人类肿瘤中均过度表达，是肿瘤血管生成的主要调控者。阻断HIF-1α 从而减少VEGF 的转录及表达，可以抑制肿瘤的生长。研究表明HIF-1α/VEGF-A 轴是癌症免疫的必需组成部分［10］。渗透肿瘤的毒性T 细胞在肿瘤内缺氧的微环境适应过程中调动HIF-1α。HIF-1α对于CD8+T 细胞的效应状态至关重要。CD8+T 细胞中HIF-1α 的丧失可以降低肿瘤的浸润能力和细胞杀伤，并减弱肿瘤的血管化。若CD8+T 细胞内缺失VEGFA，HIF 靶基因则促使肿瘤发生过程加速并同时促进血管化改变。有研究显示VEGF-A 表达和CD8+T 细胞侵袭能力之间的关系呈反比。

低氧状态能促使HIF-1α 和VEGF 在Hela 细胞中蛋白水平增高。本研究通过细胞免疫荧光染色Hela细胞，证实HIF-1α 及VEGF 在缺氧及常氧条件下的蛋白表达存在差异，在缺氧条件下，HIF-1α 及VEGF 均高表达，并且主要分布于细胞核中。提示HIF-1α 可能通过某种细胞信号通路影响VEGF 表达。有研究认为，HIF-1α 通过细胞内信号传导途径调节VEGF 表达，主要包括两方面调节作用：一是介导了VEGF mRNA 的稳定性增加；二是介导了VEGF 的转录活性增强［11］。也有学者推测，在肿瘤缺氧微环境中，表达增高的HIF-1α 经VEGF 基因转录起始点上游区域存在的缺氧反应元件诱导了下游VEGF 的高表达［12］。结合上述研究结论可推断出低氧状态在宫颈癌Hela 细胞的生长过程中具有重要作用，很可能通过影响HIF-1α 和VEGF 分子的表达从而介导肿瘤的发生、发展。

在宫颈癌Hela 细胞中，HIF-1α 和VEGF 的表达依赖氧浓度的调节，改善宫颈癌组织中缺氧微环境，可能有助于改善宫颈癌患者HIF-1α 和VEGF 的水平，从而改善患者治疗结局及远期预后。因此，低氧环境对癌症调控因子，如HIF-1α，VEGF 的影响可能为宫颈癌治疗提供新的理论基础和新的思路。