甘草查尔酮B 对人非小细胞肺癌A549 细胞增殖和凋亡的影响

张芳红 朱公建 王晓敏 张永东 李海宁 朱小康 苏海翔 郭红云

1.甘肃省医学科学研究院/甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2.兰州市西固区人民医院，甘肃 兰州 730060

肺癌的死亡率在中国居于恶性肿瘤之首，占恶性肿瘤死亡病例的24.41%，并且还在呈逐年上升的趋势［1］。许多药用植物中都含有黄酮类化合物。由于黄酮类化合物具有多种药效学功能，对人体的正常细胞毒性小，但在杀伤肿瘤细胞方面显示出较强的作用，因此其抗癌活性研究已成为热点，是颇具应用前景的新抗肿瘤药或抗肿瘤辅助药［2-3］。甘草查尔酮B（licochalcone B，LCB）是从甘草中提取出来的重要黄酮类化合物，具有较好的抑菌消炎作用，在食品和化妆品领域也有广泛的应用。既往研究发现，甘草查尔酮B 对多种肿瘤具有抑制作用，但甘草查尔酮B 对非小细胞肺癌细胞株的抑制作用还鲜有报道。本研究通过探讨甘草查尔酮B 对人肺癌细胞株A549 增殖和凋亡的影响及其可能的机制，为肺癌的临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 LCB（上海丽臣生物技术有限公司），纯度98%，C16H14O5=286.28。人肺癌细胞株A549 由甘肃中医药大学高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室惠赠。DMEM 高糖培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清（美国CLARK Bioscience 公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（均为北京Solarbio 公司），AnnexinV-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒（美国BD 公司），鼠抗人GAPDH、Bcl-2 单克隆抗体（美国Proteintech 公司），兔抗人Bax 多克隆抗体（Immunoway，美国）、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（Proteintech，美国），Western 特异发光检测试剂盒（HRP）（美国MilliPore 公司）。

1.2 仪器 BDFACSVerse TM 流式细胞仪（美国BD公司），ChemiDocTM XRSS+成像系统仪、XMarkTM MicroPlate 酶标仪（美国Bio-Rad 公司），MCO-20AIC-PC细胞培养箱（日本Panasoni 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养。将细胞置于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 高糖培养液，放入饱和湿度的培养箱中孵育，温度37℃、5%CO2。当细胞处于对数生长期时可用于实验。

1.3.2 CCK-8 法检测增殖。用0.25%胰酶消化贴壁生长的细胞，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液，计数，调整细胞密度为5×104个/mL。取100μL 细胞悬液加置96 孔板中。常规培养过夜使其贴壁后，弃上清，加入含有LCB（终浓度分别为0、10、20、40、80、120μmol/L）的DMEM高糖完全培养基200μL，作用24、48、72h 后，避光每孔加入10μLCCK-8 液，37℃孵育1h，波长450nm 处测定吸光度值。每个浓度设4 个平行孔，1 个空白调零孔，重复3 次。计算增殖抑制率及半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 平板克隆形成。按1.3.2 方法将细胞悬液调整细胞数至250 个/mL，接种2mL 于直径35mm 细胞培养皿中过夜，加入LCB（终浓度0、10、20、40μmol/L）。置于37℃，含5%CO2的培养箱中培养72h 后，换无药培养基继续培养10～14d。期间每3d 换液1 次，结束培养，甲醇固定15min，结晶紫染液染色15～25min，流水冲洗并室温放置干燥。计数克隆数，计算克隆形成率。

1.3.4 流式细胞技术检测细胞周期。按1.3.2 方法制备细胞悬液，将细胞接种于直径60mm 细胞培养皿中（6.0×105个/皿），培养过夜使其贴壁后，弃去培养液，加入含有LCB（终浓度0、10、20、40μmol/L）的培养基，继续培养72h 后，消化细胞，收集至离心管中，用预冷PBS 洗涤2 次，滴加预冷75%乙醇，冰箱冷藏固定过夜。重新1500rpm 离心5min，弃上清，PBS 清洗两遍，弃上清，每管分别加入180μL EDTA（0.1mmol/L）、20μL RNase A（10mg/mL）、35μL 2% TritonX-100、96.5μL PBS 和17.5μL PI（1mg/mL），4℃避光孵育10min。过滤，补加200μL PBS 混匀，用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3 次。

1.3.5 流式细胞技术检测细胞凋亡。按1.3.4 方法分组和给药，培养72h 后，消化收集细胞至离心管中，4℃PBS清洗2 遍。加入1×Binding Buffer 300μL 悬浮细胞后，先后加入AnnexinV-FITC 5μL，避光室温孵育15min，再加入结合液400μL 和PI 5μL，避光孵育3min，1h 内上机检测细胞凋亡率。

1.3.6 Western Blot 检测蛋白。分组给药方法同1.3.4加药培养48h 后按试剂盒提取蛋白并进行定量。加入上样缓冲液，并煮沸进行蛋白变性，SDS-PAGE 电泳，半干转膜法将蛋白转至PVDE 膜上，封闭2h，加一抗（GAPDH 抗体1 ∶8000，Bax、Bcl2、Caspase 抗体）于4℃均1 ∶1000）4℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜5 次后，再用二抗（1 ∶8000）室温孵育1.5h，继续洗5 次，ECL 显色液显色后于凝胶成像系统曝光成像，并以GAPDH 为内参，分析各目的蛋白的相对含量。

1.4 统计学分析 SPSS 22.0 软件进行统计分析，数据以±s 表示，多组均数比较采用OneWay ANOVA 进行组间两两比较采用LSD 法，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LCB 对肺癌A549 细胞增殖的影响 LCB 能显著的抑制A549 细胞增殖，抑制作用随着剂量增大和时间延长增强。LCB 作用于A549 细胞24h，其抑制率为5.30%～51.40%，IC50 为143.92μmol/L；48h，抑制率为14.32%～69.78%，IC50 为55.35μmol/L；72h，抑制率为24.20%～85.68%，IC50 为34.39μmol/L。见图1。

图1 LCB 对A549 细胞增殖的影响

2.2 LCB 对肺癌A549 细胞平板克隆形成的影响对照组的细胞克隆形成率（100±13.2）%，20μmol/L、40μmol/L LCB 细胞克隆形成率分别为（75.4±11.9）%、（65.4±10.8）%，相对于对照组的细胞克隆形成率明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 LCB 对A549 细胞平板克隆形成的影响

2.3 LCB 对A549 细胞周期的影响 LCB 干预72h 后，LCB 各剂量组G0/G1 期细胞比例明显升高（P＜0.05），可以将细胞阻滞在G1。10μmol/L、40μmol/L 组均可使S期细胞比例降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；20μmol/L、40μmol/L 组G2/M 细胞比例也明显降低（P＜0.05），10μmol/L 剂量组G2/M 细胞比例无明显变化（P＞0.05）。见图3。

图3 LCB 对A549 细胞周期的影响

2.4 LCB 对A549 细胞凋亡的影响 LCB 干预A549细胞72h，10μmol/L、20μmol/L 和40μmol/L 细胞总凋亡率分别为：（11.26±1.11）%、（14.12±1.25）%和（19.17±2.76）%，对照组为（5.38±0.25）%；总凋亡的发生率均高于对照组（P＜0.05），并且随着LCB 浓度增加，凋亡率也随之上升。LCB 干预A549 细胞72h，10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L 细胞凋亡率均高于对照组（P＜0.05），并且随着LCB 浓度增加，凋亡率随之上升。见图4。

图4 LCB 对A549 细胞凋亡的影响

2.5 LCB 对Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表达影响A549 细胞经药物干预48h，LCB 各剂量组Bax 蛋白表达升高，而Bcl-2 蛋白表达降低，Bax/Bcl-2 比值升高，与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。LCB 各剂量组干预A549 细胞48h，Caspase-3 蛋白表达量随剂量上升而增加，20μmol/L 和40μmol/L 剂量组与对照比较有统计学差异（P<0.05）。见图5。

图5 LCB 对A549 细胞BAX、Bcl-2 及Caspase-3蛋白表达的影响

3 讨论

肺癌是全球范围内发病率和死亡率很高的恶性肿瘤之一。近年来肺癌的分子靶向治疗和免疫治疗等手段的出现为患者带来了希望，但对于无靶点和出现耐药的患者化疗仍然是最常用的临床治疗方案。

LCB 为查尔酮类物质，也属于甘草黄酮类，具有保护心肌［4］、预防老年痴呆［5］和护肝［6］等生理作用，同时研究显示LCB 可以抑制多种癌细胞的增殖活性。近年来，LCB 的抗肿瘤作用日益受到关注。研究表明LCB 可以抑制人非小细胞肺癌细胞HCC827 的生长并诱导其细胞凋亡［7］，也具有诱导小鼠黑色素瘤细胞［8］、膀胱癌细胞［9］、乳腺癌细胞［10］、口腔鳞状细胞癌凋亡的作用［11-12］。本研究通过CCK-8、平板克隆形成实验及周期检测，显示LCB 能显著抑制非小细胞肺癌A549 细胞的增殖，且抑制程度随LCB 浓度的增加而增加。

细胞凋亡是一种正常的生理性保护机制，能够清除体内多余或受损的细胞，是一种精确的细胞分裂和细胞死亡之间的动态平衡。但细胞分化异常、凋亡受到抑制、细胞增殖失控均会造成肿瘤的无限生长。凋亡相关基因表达异常、突变或缺失，可以阻断细胞的凋亡，打破细胞分裂和细胞死亡的平衡，促进肿瘤的发生发展［13-14］。细胞线粒体途径凋亡的激活与外膜的通透性密切相关，当细胞受到某种程度的影响时，促凋亡基因就会从膜间隙转运到胞质中，进而启动Caspase 级联反应，诱发凋亡现象，而线粒体外膜的通透程度是由Bcl-2 家族内部多种蛋白相互调控决定。Bcl-2 家族在调控线粒体介导的凋亡途径中十分关键，其中比较重要的有抑制凋亡的Bcl-2 和促进凋亡的Bax，二者之间的相互平衡决定了生物体内细胞的存活与死亡［15-16］。Caspase 蛋白酶家族是许多介导凋亡途径的最终聚集点，而Caspase-3 为整个凋亡途径中的核心蛋白之一，是凋亡的执行者和关键酶，可与Caspase-8 酶原和Caspase-9前体蛋白相互结合，触发相应的凋亡顺序活化［17］。

本研究采用Annexin V-FITC/PI 双染法检测LCB对A549 细胞凋亡的影响。结果显示，随着LCB 浓度的增加和时间延长，细胞凋亡率明显增加，提示LCB 诱导A549 细胞凋亡呈浓度和时间依赖性。蛋白免疫印迹法进行定量检测，结果显示LCB 可以上调Bax/Bcl-2及Caspase-3 的表达，从而推测LCB 对A549 细胞的增殖抑制作用可能是通过介导线粒体途径细胞凋亡来实现的。但LCB 对A549 细胞凋亡上游的受体及其他通路的影响，有待进一步深入探讨。