亲水交互作用/高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中高氯酸盐

何国成 叶少媚 何思聪 张益文 贾晓菲

摘要 [目的]建立亲水交互作用/高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定茶叶中高氯酸盐的方法。[方法]采用水溶液萃取茶叶中高氯酸盐，经Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，用Obelisc R色谱柱分离，以高效液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。[结果] Obelisc R色谱柱能良好地增加保留时间至4.9 min，高氯酸根在1～200 ng/mL线性良好（R2>0.999 6），回收率为79.3%～115.3%，相对标准偏差（RSD）≤9.4%，定量限为35 μg/kg。[结论]该方法操作简单、分离效果好、灵敏度能满足欧盟拟定限量的要求，适用于茶叶中高氯酸盐残留测定，为我国进一步规范茶叶安全标准提供技术支持。

关键词 亲水交互作用;高效液相色谱-串联质谱法;高氯酸盐;保留时间;茶叶

中图分类号 TS 272.7  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0171-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.044

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Detection of Perchlorate in Tea by High Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry and Hydrophilic Interaction Method

HE Guo-cheng，YE Shao-mei，HE Si-cong et al

（Zhongshan Quality Safety & Inspection Institute of Agricultural Products， Zhongshan，Guangdong 528437）

Abstract [Objective]To establish a high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method for the determination of perchlorate in tea. [Method]Perchlorate in tea was extracted by aqueous solution and purified by Oasis PRiME HLB solid phase extraction column， separated by Obelisc R chromatographic column， determined by high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry， and quantified by isotope internal standard method. [Result]The retention time of Obelisc R column could be well increased to 4.9 minutes. The linearity of perchlorate was good at 1-200 ng/mL （R2>0.999 6）， the recovery rate was 79.3%-115.3%， the relative standard deviation （RSD） was not greater than 9.4%， and the quantitative limit was 35 μg/kg. [Conclusion]The method has the advantages of simple operation and good separation effect， of which the sensitivity meet the requirements of the limit formulated by the European Union. It is suitable for the determination of perchlorate residue in tea and can provide a reference and theoretical basis for further standardizing tea safety standards.

Key words Hydrophilic interaction;High performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method;Perchlorate;Retention time;Tea

2016年，我國出口欧盟的茶叶被曝检出高含量“高氯酸盐”[1]，该事件引起了社会对茶叶质量安全问题的关注，特别是高氯酸盐的污染。高氯酸盐是一种新型环境污染物[2]，在食品、土壤和植物[3-7]中均被检出。高氯酸盐经食物在人体富集发挥毒性作用，它可以干扰甲状腺功能、新陈代谢，阻碍人体生长发育，损害儿童脑部发育[8]。

目前，我国尚未对茶叶中高氯酸盐含量作出规定，检测标准只有行业标准《出口食品中高氯酸盐的检测 液相色谱-质谱/质谱法》（SN/T 4089—2015），但该检测标准的适用范围并未涉及茶叶。现有检测文献大多采用水性溶剂进行提取，经C18固相萃取柱净化，由离子色谱法（IC）、离子色谱-串联质谱法（IC-MS/MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行测定[9-11]。在液相色谱-串联质谱法分析中，高氯酸盐在大多数色谱柱中保留能力欠缺（<2 min），而使用离子交换色谱柱可获得较好的保留时间（>4 min）。D38D0108-D218-4E9E-B95A-B064107A707C

该研究使用的Obelisc R色谱柱是结合离子交换的HILIC色谱柱，用于亲水交互作用色谱的固定相为极性，易吸附样品溶液中的极性分子，从而促进目标物从流动相中分配至固定相表面上的极性液层。该研究以纯水萃取茶叶中高氯酸盐，经PRiME HLB固相萃取柱净化，使用Obelisc R色谱柱增加保留时间（4.9 min），以LC-MS/MS测定，18O高氯酸钠同位素内标法定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 高氯酸钠标准溶液（1 000 μg/mL，美国，o2si公司）;18O高氯酸钠同位素内标（100 μg/mL，美国，CIL公司）;乙腈（质谱纯，美国，Fisher公司）;正己烷（分析纯，广州化学试剂厂）;甲酸铵（色谱纯，美国，Fluka公司）;试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

1290-6495A高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国，安捷伦公司）; Waters Oasis PRiME HLB净化柱（3 mL/60 mg，美国，Waters公司）;Sielc Obelisc R色谱柱（2.1 mm×100 mm，5 μm，美国，Sielc公司）;A11Basic研磨机（德国，IKA公司）;Millipore Mili-Q纯水机（美国，密理博公司）;vortex 2漩涡振荡器（德国，IKA公司）;THZ-82A水浴恒温振荡器（金坛市宏华仪器厂）;3-18KS高速离心机（德国，SIGMA公司）;KS-501振荡器（德国，IKA公司）;KQ-500TDE超声机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制。

用高纯水逐级稀释高氯酸钠标准溶液（1 000 μg/mL），最终配制成高氯酸根浓度分别为0、1、5、20、100 、200 ng/mL的标准工作液，现配现用。18O高氯酸钠同位素内标最终质量浓度为20 ng/mL。

1.3.2 样品前处理方法。

称取0.50 g试样于50 mL离心管中，加入内标（4 μg/mL）100 μL、20 mL高纯水，漩涡混匀。在恒温水浴振荡器45 ℃振荡2 h，超声30 min。吸取5 mL到另一离心管中，加3 mL正己烷，摇床振荡15 min，高速离心，取2 mL水相提取液到PRiME HLB 净化柱中（下接滤膜），加压使流速2 s/滴，弃初始液0.3 mL，收集于2 mL棕色样品瓶内，待测定。同时做试剂空白。

1.3.3 仪器条件。

1.3.3.1 色谱条件。色谱柱为Sielc Obelisc R（2.1 mm×100 mm，5 μm）。流动相A为10 mmol/L甲酸铵（含0.10%甲酸），B为90%乙腈（含0.10%甲酸）;等度洗脱，A+B=15%+85%;流速0.3 mL/min;柱温25 ℃;进样量1 μL;运行时间8 min/针。

1.3.3.2 质谱条件。电喷雾电离源（ESI），负离子-多反应监测（MRM）采集模式。干燥气温度200 ℃;干燥气流速14 L/min;鞘气温度250 ℃;鞘气流速11 L/min;雾化器压力275.79 kPa;监测离子对m/z为101-85（定性离子）、99-83（定量离子），内标为107-89，对应的碰撞能（CE）均为18 eV;驻留时间150 ms，EMV增益200。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

ClO4-是一种极性极强的无机化合物，在色谱分离时，在普通C18色谱柱上几乎不保留，且存在基质效应。宋正规等[12-13]使用一般HILIC色谱柱进行分离，保留时间约1. 5 min;华永有等[14]使用T3色谱柱进行分离，保留时间约1.6 min;李雨哲等[15-16]使用陰离子交换色谱柱进行分离，保留时间约7 min。目前研究质谱法测定高氯酸盐，大多以阴离子交换色谱柱增强保留能力，其他类型色谱柱保留能力略有不足。该研究所用色谱柱保留时间可达4.9 min（图1），结果表明，Obelisc R柱对高氯酸根有较强的保留能力。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择。

对于大多数亲水色谱（HILIC）模式有机相通常选用乙腈，而不是甲醇。乙腈在HILIC模式下属于弱洗脱的流动相，且产生的柱压比甲醇低。甲醇属于质子溶剂，由于其极性性质，会与待测物竞争固定相上的极性结合位点，并抑制水层的形成，导致保留变弱。水在此模式则作为强洗脱溶剂，在水相比例3%～40%时，增加水相比例可以增加洗脱能力。因此该研究选择乙腈和水作为基础流动相，且在提取液中不添加甲醇。

2.2.2 流动相的选择。HILIC模式下提高甲酸铵浓度可减弱离子交换作用，屏蔽硅醇基电荷，减弱硅醇基对带电化合物的保留能力，优化峰型。比较4种A相中不同浓度甲酸铵溶液，B相为90%乙腈，探讨甲酸铵浓度对保留时间的影响。结果见表1。

从表1可以看出，随着甲酸铵浓度减少，ClO4-保留能力逐渐增加，直至在8 min内不出峰。考虑到质谱分析中甲酸铵的浓度超过20 mmol/L时容易造成离子源盐析，故该研究最终选用A相甲酸铵浓度为10 mmol/L。

以A相10 mmol/L甲酸铵溶液、B相90%乙腈为基础，比较5种不同甲酸含量对保留时间的影响，结果见表2。从表2可以看出，甲酸含量≤0.20%时，随着甲酸含量增大，ClO4-保留能力逐渐增强;甲酸含量对ClO4-峰面积无明显作用。在仅考虑保留能力情况下，选用0.10%甲酸含量较为合适。

2.2.3 色谱柱温度的优化。

在A相10 mmol/L甲酸铵（含0.10%甲酸）、B相90%乙腈（含0.10%甲酸）的基础上，比较4种柱温25、30、35、40 ℃，得到ClO4-保留时间分别为4.9、4.7、4.6、4.5 min，可见柱温对ClO4-峰面积无明显作用。随着柱温上升，ClO4-保留能力逐渐减弱，且作用明显。考虑该研究目的是增加ClO4-的保留能力，故选用柱温25 ℃。D38D0108-D218-4E9E-B95A-B064107A707C

2.3 线性范围

标准曲线的线性范围1～200 ng/mL，以定量离子和内标峰面积的比值作为Y轴，以高氯酸根和内标浓度的比值作为X轴，通过统计学方法进行线性拟合，得出线性回归方程为Y=1.820 575X+0.183 374（R2>0.999 6），线性关系良好。

2.4 准确度和精密度

选取高氯酸盐本底低的3种茶叶，以40、80、400 μg/kg添加水平重复测定6次，扣除本底后测定结果如表3所示。由表3可知，此次试验回收率在79.3%～115.3%，RSD≤9.4%，说明该方法具有较好的准确度和精密度。

2.5 定量限

按10倍信噪比（S/N）为定量限计算，白茶、红茶、绿茶的定量限分别为23、35、18 μg/kg，故该方法的定量限为35 μg/kg，满足欧盟拟定茶叶中高氯酸盐参考残留量（0.75 mg/kg）。

2.6 样品测定 应用该方法对110份茶叶样品进行测定，其中高氯酸盐含量>0.75 mg/kg有 8份，占比7.3%，说明茶叶中高氯酸盐污染存在一定风险，应引起相关部门重视。

3 结论

该研究采用Obelisc R分离技术，有效地解决了高氯酸盐在反相色谱上保留性能不佳、基质效应干扰严重的检测难点。该方法操作简单、分离效果好、灵敏度能满足欧盟拟定限量的要求，适用于茶叶中高氯酸盐残留测定，为我国进一步规范茶叶安全标准提供技术支持。

参考文献

[1]

吴微，冯德建，许洋，等.茶叶中高氯酸盐的污染情况及健康风险初步评估[J].食品工业科技，2020，41（4）：173-178.

[2] 韦昱，方从容，赵云峰，等.分散微固相萃取/超高效液相色谱-高分辨质谱法测定茶叶中高氯酸盐[J].分析测试学报，2021，40（4）：583-588.

[3] DYKE J V，KIRK A B，MART INELANGO P K，et al.Sample processing method for the determination of perchlorate in milk[J].Anal Chim Acta，2006，567（1）：73-78.

[4] FDA.Rapid determination of perchlorate anion in foods by ion chromatography-tandem mass spectrometry.Revision 2[EB/OL].（2005-04-12） [2016-04-19].http：∥www.fda.gov /Food /Foodbor-neIllnessContaminants /ChemicalContaminants /ucm077793.htm.

[5] TIAN K，CAAS J E，DASGUPTA P K，et al.Preconcentration /preelution ion chromatography for the determination of perchlorate in complex samples[J].Talanta，2005，65（3）：750-755.

[6] KIRK A B，MARTINELANGO P K，TIAN K，et al.Perchlorate and iodide in dairy and breast milk[J].Environ Sci Technol，2005，39（7）：2011-2017.

[7] EI ARIBI H，LE BLANC Y J C，ANTONSEN S，et al.Analysis of perchlorate in foods and beverages by ion chromatography coupled with tandem mass spectrometry （IC-ESI-MS/MS）[J].Anal Chim Acta，2006，567（1）：39-47.

[8] 蔡亞岐，史亚利，张萍，等.高氯酸盐的环境污染问题[J].化学进展，2006，18（11）：1554-1564.

[9] 孟维伟.茶叶中高氯酸盐的检测——离子色谱法[J]. 轻工科技，2016，32（11）：12-13.

[10] 孙文闪，诸骏杰，余鹏飞，等.分散固相萃取净化离子色谱-串联质谱测定茶叶中高氯酸盐[J].食品安全质量检测学报，2019，10（20）：6927-6932.

[11] 陈东，范赛，沙博郁，等.同位素标记-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中的高氯酸盐[J].中国卫生检验杂志，2017，27（16）：2298-2300.

[12] 宋正规，张书芬，周子焱，等.超高效液相色谱-串联质谱同时测定茶叶中高氯酸盐和氯酸盐[J].茶叶科学，2017，37（6）：597-604.

[13] 姚清华，柯秋璇，李捷，等.固相萃取/18O标记高氯酸根稀释高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定茶叶中高氯酸盐[J].分析科学学报，2018，34（4）：565-568.

[14] 华永有，李宇翔，林宏琳，等.茶叶中高氯酸盐检测与污染情况分析[J].海峡预防医学杂志，2018，24（1）：4-6，12.

[15] 李雨哲，杨杰，王雨昕，等.同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中的高氯酸盐[J].中国食品卫生杂志，2016，28（5）：616-619.

[16] 刘小芳，方从容，刘慧，等.离子色谱-串联质谱法检测茶叶中的高氯酸盐[J].色谱，2016，34（10）：986-988.D38D0108-D218-4E9E-B95A-B064107A707C