超高效液相色谱-质谱联用法测定发酵肉和发酵蔬菜中5种生物胺

虞太六

摘 要：建立了发酵肉和发酵蔬菜中5种生物胺的高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经5%高氯酸水溶液提取，用正己烷对样品进行净化。以液相色谱质谱联用仪检测萃取液中BAs的含量，采用HILIC柱分离，正ESI电离和MRM定性分析，采用外标法进行定量分析。5种BAs在1.0～1 000.0 ng/mL线性良好，相关系数R>0.995，检出限为0.001 60～0.002 26 mg/kg，定量限为0.008 21～0.182 00 mg/kg。尸胺、腐胺和酪胺在添加水平分别为2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，组胺和色胺在添加水平分别为0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相对标准偏差为0.80%～8.69%。该方法快速、简单、准确，适用于发酵肉和发酵蔬菜样品中5种BAs的检测。

关键词：高效液相色谱-质谱联用;生物胺;发酵肉;发酵蔬菜

Determination of Five Biogenic Amines in Fermented Meat and Fermented Vegetables by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YU Tailiu

（Shanghai Huabiao Testing Technology Service Co.， Ltd.， Shanghai 201112， China）

Abstract： A method was developed for the determination of 5 biogenic amines in fermented meat and fermented vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with 5% perchloric acid， and then cleaned-up by hexane. The 5 BAs were analyzed by liquid chromatography mass spectrometer with a HILIC chromatographic column， adopting the MRM mode with positive ESI. For accurate quantitative analysis， the external standard method was used. The calibration curves were linear with the correlation coefficients over 0.995 in the range of 1.0～1 000.0 ng/mL for the 5 BAs. The limits of detection were 0.001 60～0.002 26 mg/kg， The limits of quantification were 0.008 21～0.182 00 mg/kg. The mean recoveries of the cadaverine tyramine and putrescine at spiked levels of 2 mg/kg， 10 mg/kg， 50 mg/kg and of the histamine and tryptamine at spiked levels of 0.2 mg/kg， 1.0 mg/kg， 5.0 mg/kg were in the range from 79.0% to 98.0% with the relative standard deviations of 0.80%～8.69%. The developed method is rapid， simple， accurate. It is suitable for the determination of the 5 BAs in large quantities of fermented meat and fermented vegetable samples.

Keywords：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; biogenic amines; fermented meat; fermented vegetables

生物胺（Biogenic Amines，BAs）廣泛存在于各种食品中，且水产品、酒类产品、肉制品和乳制品等一般发酵食品中生物胺含量明显高于非发酵食品[1]。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，而过量摄入会产生不良反应。目前，检测食品中生物胺的方法主要有液相色谱法[2]、气相色谱法[3]、薄层色谱法[4]和毛细管电泳法[5]。本文用5%高氯酸冰浴超声提取，离心，取上清液，调节pH并定容，经正己烷净化，建立食品中5种生物胺的高效液相色谱-质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱Waters Xevo TQ-S，美国Waters公司;超声波提取器、恒温水浴振荡器、涡旋振荡器，上海安谱实验科技股份有限公司。分析天平，美国Mettler Toledo公司;离心机，湖南湘仪离心机有限公司;离心管，上海安谱实验科技股份有限公司;超纯水仪，美国Millipore公司。87802F42-BF74-432F-92D9-02027006B9AA

乙腈（HPLC级）、高氯酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、甲酸和甲酸铵（HPLC级）。尸胺、腐胺、酪胺、组胺和色胺标准品，纯度>98%。

1.2 标准溶液配制

（1）标准储备液的配制（1.0 mg/L）。分别准确称取适量尸胺、腐胺、酪胺、组胺和色胺分别用水溶解并定容至10 mL，配制成浓度为1.0 mg/L的标准品储备液，4 ℃保存，有效期1个月。

（2）混合标准品中间液（尸胺、腐胺和酪胺：200 μg/mL;组胺和色胺：20 μg/mL）。准确移取尸胺、腐胺和酪胺2 mL，组胺和色胺0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，4 ℃保存，有效期1个月。

（3）混合标准工作液（尸胺、腐胺和酪胺：2 μg/mL;组胺和色胺：0.2 μg/mL）。取0.1 mL混合标准品中间液置于10 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，4 ℃保存，有效期2周。

（4）准确移取生物胺混合标准工作液（尸胺、腐胺、酪胺浓度为2 μg/mL，组胺和色胺浓度为0.2 μg/mL）0.050 mL、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.000 mL、2.500 mL和5.0 mL分别置于10 mL的容量瓶中，用0.5%高氯酸溶液-乙腈溶液（准确量取25 mL 0.5%高氯酸溶液用乙腈定容至100 mL，混匀）稀释并定容，其中尸胺、腐胺和酪胺浓度为10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL和1 000 ng/mL;组胺和色胺浓度为1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL和100.0 ng/mL，现配现用。

1.3 样品前处理

称取2 g试样（精确至0.01 g）试样于50 mL刻度离心管中，加入20 mL 5%高氯酸溶液，旋涡5 min，冰浴超声20 min，5 000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一50 mL刻度试管中;样品残渣再加入20 mL 5%高氯酸溶液重复提取一次，合并上清液。往上述上清液中加入适量400 g/L氢氧化钠溶液调节pH至2～3，用0.5%高氯酸溶液定容至50 mL。取2 mL上述溶液至离心管中，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加入5 mL正己烷，振荡混匀，离心，弃去正己烷层;再加入5 mL正己烷净化，弃去正己烷层。吸取0.25 mL上述溶液至玻璃管中，加入0.75 mL乙腈，混匀，过0.22 μm滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.4 分析条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters XBridge HILIC色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相：A为含10 mmol/L甲酸铵、0.5%甲酸的水溶液，B为含10 mmol/L甲酸铵、0.5%甲酸的乙腈溶液;流速：0.3 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：2 μL。流动相梯度洗脱程序见表1。

（2）质谱条件。电离源：ESI+;毛细管电压：4.0 kV;

离子源温度：150 ℃;脱溶剂温度：400 ℃;脱溶剂气流量：800 L/h;检测方式：MS/MS，参数见表2。

2 结果与分析

2.1 分析条件优化

2.1.1 方法的线性范围、检出限和定量限

采用内标法定量，分别以3倍和10倍信噪比（S/N）确定目标分析物的检出限和定量限。测得发酵肉和发酵蔬菜中5种BAs的检出限为0.001 60～0.002 26 mg/kg，定量限为0.008 21～0.182 00 mg/kg。5种BAs的标准曲线的相关系数均大于0.995。

2.1.2 方法的回收率和精密度

采用空白样品中添加标准溶液的方法，进行添加回收实验，尸胺、腐胺和酪胺添加水平分别为2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，组胺和色胺添加水平分别为0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照优化后的方法进行测定，每个质量浓度点平行测定6次，外标法校正。由表3实验数据可知，在添加范围内BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相对标准偏差为0.80%～8.69%。

2.1.3 实际样品测定

使用建立的方法对10种发酵肉和10种发酵蔬菜中5种BAs残留进行分析。20个样品的测试结果表明如下。10种发酵肉中尸胺样品浓度为ND～152 mg/kg，腐胺样品浓度为ND～96.2 mg/kg，酪胺样品浓度为ND～344 mg/kg，组胺样品浓度为ND～484 mg/kg，色胺样品浓度为ND～39.8 mg/kg。10种发酵蔬菜中尸胺样品浓度为ND～132 mg/kg，腐胺样品浓度为ND～122 mg/kg，酪胺样品浓度为ND～194 mg/kg，组胺样品浓度为ND～55 mg/kg，色胺样品浓度为ND～2.55 mg/kg。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-质谱串联技术测定发酵肉和发酵蔬菜样品中5种BAs残留的分析方法。该方法的线性关系、准确度和精密度均能满足残留分析要求，其前处理方法简单、净化效果良好，适用于大量发酵食品样品中5种BAs含量的快速检测。

参考文献

[1]ORD??EZ J L，TRONCOSO A M，GARC?A-PARRILLA M D C，et al.Recent trends in the determination of biogenic amines in fermented beverages： a review[J].Analytica Chimica Acta，2016，939：10-25.

[2]ONAL A.A review： current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods[J].Food Chem，2007，103（4）：1475-1486.

[3]FERNANDES J O，FERREIRA M A.Combined ion-pair extraction and gas chromatography-mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines， polyamines and aromatic amines in Port wine and grape juice[J].J Chromatogr A，2000，886（1/2）：183-195.

[4]张微，李秀缺，陆容，等.浅谈食品中生物胺的检测方法[J].食品工程，2007（4）：55-57.

[5]CHIU T C，LIN Y W，HUANG Y F，et a1.Analysis of biologically active amines by CE[J].Electrophoresis，2006，27（23）：4792-4807.87802F42-BF74-432F-92D9-02027006B9AA