液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中恩诺沙星残留量的不确定度评估

李苗 代菲 纪丽君 丁洪流

摘 要：目的：评估液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中恩诺沙星残留量的不确定度。方法：依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06：2006）《测量不确定度要求的实施指南》（CNAS—GL05：2011），建立鱼肉中恩诺沙星残留量不确定度数学模型，分析其结果的不确定度来源。结果：当鱼肉中恩诺沙星含量为60.80 ?g/kg时，其扩展不确定度为6.32 ?g/kg（k=2），不确定度主要来源于工作曲线拟合，标准曲线溶液配制，仪器所产生的不确定度。结论：调整标准曲线的权重，提高检验人员的操作水平，定期校准液相色谱-串联质谱仪，使其准确，可提高样品测定结果的可靠性。

关键词：液相色谱-串联质谱;恩诺沙星;不确定度;鱼肉

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Fish by LC-MS/MS

LI Miao， DAI Fei， JI Lijun， DING Hongliu*

（Suzhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Suzhou 215104， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in fish by liquid chromatography-tandem mass spectrometry is evaluated. Method： According to“Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”（JJF 1059.1—2012）、 CNAS—GL06：2006 and CNAS—GL05：2011 ， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in fish by LC-MS/MS was established， and the uncertainty sources of the results that may be introduced were analyzed. Result： When the content of enrofloxacin in fish was 60.80 ?g/kg， the expanded uncertainty was 6.32 ?g/kg（k=2）. The uncertainty mainly comes from the uncertainties that caused by the working curve fitting， the standard curve solution preparation and the uncertainty. Conclusion： Adjust the weight of the standard curve， improve the operation level of inspectors， and regularly calibrate liquid chromatography tandem mass spectrometry to make it accurate， so the reliability of the determination results is improved.

Keywords： liquid chromatography tandem mass spectrometry; enrofloxacin; uncertainty; fish

本实验依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06：2006）[2]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[1]，参照农业部1077号公告—1—2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法[3]，对LC-MS/MS外标法测定鱼肉中恩诺沙星残留量的不确定进行分析，为实验室内部质量控制提供数据支持，保障实验数据准确性、可靠性。

1 材料与方法

1.1 试剂耗材

标准品：恩诺沙星（美国A Chemtek公司）;甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）;无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h，冷却后贮存于密闭容器中备用，分析纯，国药集团试剂有限公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水一级水。

1.2 仪器设备

ACQUITY UPLC/TQ-XS液相色谱-串联质谱，美国Waters公司;離心机，艾本德;Multi Reax涡旋仪，德国海道尔夫公司;超声波清洗仪，德国Elma;多通道旋蒸仪，德国IKA。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

称取5 g试样于50 mL离心管内，加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入于20 mL酸化乙腈，涡旋混合，超声提取10 min。以4 000 r/min离心5 min，取上清液于梨形瓶中。残渣中再加入20 mL酸化乙腈溶液，重复提取一次，合并两次提取液，提取液于40 ℃水浴中旋转至干。加10.0 mL甲醇溶解残留物，再加入2 mL正己烷涡旋混合30 s，转入离心管中，以4 000 r/min离心5 min，弃上层液，取下清液，过0.22 ?m滤膜，待液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 不确定度来源分析

通过对测量过程的分析，并结合计算公式，可以归纳出以下几个不确定度来源[5]。①测量重复性引起的不确定度（A类）。②样品前处理引起的不确定度（B类）（天平引起的不确定度与1.0 mL移液管引起的不确定度）。③标准曲线溶液配制带入的不确定度（B类）。④工作曲线拟合引起的不确定度（B类）。⑤仪器引起的不确定度（B类）。2D046ED9-E581-4F19-B6CA-233363C545A4

1.3.3 数学模型建立

数学模型建立如下：

（1）

式中：X样为试样中恩诺沙星的含量，?g/kg;

m样为鱼肉的质量，g;C样为样液中恩诺沙星的浓度，ng/mL;CBlank为空白中恩诺沙星的浓度，ng/mL;

V为样液最终的定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 测量重复性引起的相对标准不确定度urel（d ）（A类）

按农业部1077号公告—1—2008方法对同一样品平行测定6次，结果见表1。由重复性测定结果可得测量标准偏差S，并计算重复性相对标准不确定度urel（d）为：

式中：xi为第i次测量的测定值，?g/kg;n为测量次数;x为n次测量所得的算术平均值，?g/kg。

2.2 样品前处理引起的相对标准不确定度urel（r）（B类）

2.2.1 天平引起的相对标准不确定度urel（r1）

称取5 g试样，天平的准确度a为0.01 g，采用矩形分布计算天平的不确定度和相对标准不确定度为：

2.2.2 1.0 mL移液管引起的相对标准不确定度urel（r2）

样品前处理过程加入1.0 mL流动相溶解残留物，1.0 mL移液管准确度a为±0.007 mL，见表2，采用矩形分布计算1.0 mL移液管的不确定度和相对标准不确定度为：

将以上样品前处理过程中各相对标准不确定度，按照下列公式进行合成，则样品前处理引起的相对标准不确定度。

2.3 标准曲线溶液配制带入的相对标准不确定度urel（s）（B类）

2.3.1 标准溶液准确度引起的相对标准不确定度urel（s1）

本实验采用的恩诺沙星标准溶液由BePure公司提供，浓度为100.2 ?g/mL，已知标准物质证书给出的恩诺沙星的不确定度a为±3%（k=2），恩诺沙星标准溶液的相对标准不确定度为：

2.3.2 稀释体积带入的相对标准不确定度urel（s2）

据《常用玻璃量器计量检定规程》（JJG 196—2006）[4]A级玻璃量器的允差（表2），按均匀分布。各移液管和容量瓶的标准不确定度见表2。

其中，1 mL移液管移取1.0 mL 100.2 ?g/mL标准溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容得到浓度为1 ?g/mL的标准溶液，将1 ?g/mL的标准溶液进行逐级稀释，配制成浓度点为1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、40 ng/mL和50 ng/mL的标准系列，分别计算移液管和容量瓶的相对不确定值，见表3。

则稀释体积带入的相对标准不确定度为：

将以上标准曲线溶液配制过程中各相对标准不确定度，按照下列公式进行合成，则标准曲线溶液配制带入的相对不确定度为：

2.4 工作曲线拟合引起的相对标准不确定度urel（p）（B类）

配制6个浓度的标准溶液，用LC-MS/MS重复测定3次，得到各浓度的色谱峰面积，用最小二乘法对恩诺沙星浓度-峰面积进行拟合，得到标准工作曲线为y=ax+b（y为峰面积，x为浓度）和相关系数，结果见表4。

根据表4中标准工作曲线y=91 996.2x+18 727.1，进行数据分析，各浓度点峰面积计算结果见表5。

由表5可知，标准系列溶液浓度的平均值x=21.83 ng/mL，由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

式中：s为标准溶液峰面积残差的标准偏差，;sxx为标准溶液浓度残差的平方和，;x为标准溶液浓度的平均值，x=21.83 ng/mL;x为对样品进行6次测定，由直线方程求得的样品6次测定结果的平均浓度，ng/mL（6次测定浓度分别为30.31 ng/mL、30.41 ng/mL、29.55 ng/mL、30.32 ng/mL、30.66 ng/mL和31.19 ng/mL，则x=30.41 ng/mL）;b为工作曲线的斜率，为91 996.2;a为工作曲线截距，18 727.1;yj为第j个标准溶液的峰面积，cps;xj为第j个标准溶液的浓度，ng/mL;n为测试标准溶液的次数，n=6;p为测试样品的次数，p=6。

2.5 LC-MS/MS仪器引起的相对标准不确定度urel（X）（B类）

经检定，LC-MS/MS仪器的不确定度为0.02，k=2，由LC-MS/MS仪器引入的相对标准不确定度为。

3 合成标准不确定度的评定各相对标准不确定度见表6。

由表6可知，鱼肉中恩诺沙星检测结果的合成标准不确定度ucrel为：

4 擴展不确定度的评定与结果

根据CNAS—GL06：2006[2]，取k=2，被测量值大约95%含于此区间，则相对扩展不确定度为U=ucrel×k=0.051 90×2=0.104。本次实验测得样品中恩诺沙星的最佳估值为X=60.8 ?g/kg，则其扩展不确定度为U=60.8 ?g/kg×0.104≈6.32 ?g/kg。

5 结论

在LC-MS/MS测定鱼肉中恩诺沙星残留量时，应调整标准曲线的权重，降低工作曲线拟合引起的不确定度，提高检验人员的操作水平，定期对仪器进行校准，测试平行样，严控前处理各环节，减少引入的不确定度，提高检测结果的准确性。

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[2]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL06：2006[EB/OL].（2008-08-11）[2022-01-24].https：//www.taodocs.com/p-41562968.html.

[3]中华人民共和国农业部.农业部1077号公告—1—2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[EB/OL].（2006-06-01）[2022-01-24].https：//www.doc88.com/p-3691023672608.html.

[4]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器计量检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国标准出版社，2006.

[5]中国合格评定国家认可委员会.测量不确定度要求的实施指南：CNAS—GL05：2011[EB/OL].（2011-02-15）[2022-01-24].https：//wenku.so.com/d/e42a64fa2fafd0745bc72a3e5230cbf4.

基金项目：表面增强拉曼光谱法同时检测多种含氰基有害污染物的快速筛查技术应用研究（SS019016）。

作者简介：李苗（1987—），女，江苏徐州人，本科，工程师。研究方向：食品安全与质量控制。

代菲（1979—），女，四川乐山人，本科，工程师。研究方向：食品安全与质量控制。

纪丽君（1986—），女，山东德州人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全与质量控制。

通信作者：丁洪流（1979—），女，江苏镇江人，博士，正高级工程师。研究方向：食品安全与质量控制。E-mail：416811320@qq.com。2D046ED9-E581-4F19-B6CA-233363C545A4