ADS-7大孔树脂连续使用对苦荞精制品中黄酮成分的影响

李 姝，王松涛，张 娜，贾俊杰，焦 威，刘 怡，赵 建，沈才洪

(1.泸州品创科技有限公司，四川 泸州 646000; 2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000; 3.四川大学生命科学学院 资源微生物学与生物技术教育部重点实验室，四川 成都 610064; 4.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041)

0 引 言

大孔树脂是一种理化特性稳定，比表面积较大的多孔微球吸附剂[1-2]。带有不同功能基的大孔树脂，其可能通过范德华力、静电力、氢键力等多种吸附力对提取物中的有效成分进行选择性吸附，由于吸附作用不同，可以通过不同溶剂洗脱吸附的物质，由此达到富集目标成分或去除杂质的目的。大孔树脂吸附法以其分离效果好、可重复利用、操作简便、容易工业转化等优势，目前已广泛用于黄酮类、皂苷类、多糖、花色苷等成分的分离纯化[3-6]。

苦荞（Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn.）是一种重要的药食两用粮食作物[7]。黄酮类化合物被认为是苦荞中的主要活性成分，已有研究报道黄酮类化合物具有降三高、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种功效[8-10]。目前，对于黄酮类成分的富集方法较多，其中以大孔树脂法最为常用有效，不同类型的大孔树脂中又以AB-8、D101等应用较为广泛[11-13]。项目前期研究发现相较AB-8、D101型大孔树脂，ADS-7用于富集苦荞麸皮中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚4种黄酮类物质的效果更佳[14]。虽然近年来采用大孔树脂富集黄酮的研究越来越多，但涉及大孔树脂富集苦荞黄酮使用寿命的文献尚未见报道。本研究拟通过结合AlCl3分光光度法及高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC），首次考察ADS-7大孔树脂富集苦荞黄酮的使用次数及对苦荞精制品中4种主要黄酮成分芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚含量的影响，以期为苦荞黄酮精制品的规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

乙醇（纯度≥ 95%，食品级）、甲醇（分析纯）、AlCl3（分析纯）、CH3COOK（分析纯），均购于成都市科隆化学品有限公司；芦丁（纯度≥ 99%）、烟花苷（纯度≥ 98%）、槲皮素（纯度≥ 99%）、山奈酚标样（纯度≥ 98%）均购于成都普思生物科技股份有限公司；苦荞麸皮原料购于四川环太生物科技股份有限公司。

1.2 实验仪器

LC-16型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；紫外可见分光光度计（翱艺仪器（上海）有限公司）；SHZ-DIII循环水式多用真空泵（巩义市科华仪器设备有限公司）；YRE-301旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HZK-FA210万分之一电子分析天平（福州华志科学仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州汇成科工贸有限公司）；PCWJ-10超纯水系统（成都品成科技有限公司）；ADS-7大孔树脂（天津浩聚树脂科技有限公司）；玻璃层析柱（上海禾汽玻璃仪器有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 AlCl3分光光度法

本实验采用AlCl3分光光度法[15]用于测定上样滴出液、洗杂液及洗脱液中总黄酮的量。

1) 标准曲线的建立

准确称量芦丁标样5.0 mg，置于容量瓶中，70%的甲醇溶液溶解，定容至25 mL，振荡均匀，静置，得到0.20 mg/ mL的芦丁标样溶液。分别移取上述溶液 0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加入 70% 的甲醇 5 mL，0.1 mol/L 的 AlCl3溶液 2 mL，1.0 mol/L 的 CH3COOK 溶液3 mL，用 70% 的甲醇溶液定容至25 mL，常温下静置 0.5 h，紫外分光光度计420 nm处测定吸光度，以空白试剂作为对照。以标样的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2) 供试液的测定方法

取供试液 0.5 mL于 25 mL容量瓶中，加入70% 的甲醇 5 mL，0.1 mol/L 的 AlCl3溶液 2 mL，1.0 mol/L 的 CH3COOK 溶液 3 mL，70% 的甲醇溶液定容，常温下静置0.5 h，紫外分光光度计420 nm处测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算上样滴出液、洗杂液及洗脱液中总黄酮的量。

1.3.2 HPLC 法

实验采用HPLC法测定苦荞精制品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚4种主要黄酮成分的含量[14]。根据标准曲线的回归方程分别计算4种黄酮的含量，并通过将洗脱液减压旋蒸至干称量得总干膏量，由下式计算4种黄酮总含量（纯度）：

式中：C1——芦丁含量，mg/mL；

C2——烟花苷含量，mg/mL；

C3——槲皮素含量，mg/mL；

C4——山奈酚含量，mg/mL；

V——洗脱液总体积，mL；

M——洗脱液总干膏量，mg。

1.4 ADS-7大孔树脂富集苦荞黄酮精制品的方法

称取苦荞麸皮粉适量，按照料液比为1∶10量取70%食品级乙醇，采用热回流提取法进行提取，提取温度为60 ℃，提取 3次，每次3 h。合并3次提取液后过滤，并将滤液用旋转蒸发仪浓缩干燥，即得苦荞黄酮粗制品。

取适量苦荞黄酮粗制品，用纯水充分稀释使上样液浓度为 1 mg/mL。将 50 g ADS-7 大孔树脂加入适量纯水一起拌入层析柱（径高比=1∶8.4）中，用纯水清洗大孔树脂直至流出液透明澄清为止。随后以2 BV/h的速度上样，收集上样滴出液。再用适量纯水清洗大孔树脂直至流出液透明澄清为止，收集洗杂液。洗杂后采用90%食品级乙醇洗脱吸附于ADS-7大孔树脂上的黄酮类化合物，收集6 BV亮黄色的洗脱液，减压浓缩干燥并回收乙醇，得浅黄色粉末，即为苦荞黄酮精制品[14]。

1.5 ADS-7大孔树脂使用次数考察

待完成1次上样洗脱后，需用纯水清洗大孔树脂至流出液无明显乙醇气味为止。冲洗后可继续上样，重复上述操作，收集每次的上样滴出液、洗杂液及洗脱液，采用AlCl3分光光度法检测吸光度，以黄酮吸附量、吸附率、解吸率、洗脱液总黄酮量及总干膏量为指标考察大孔树脂连续使用的情况。同时，采用HPLC法测定苦荞精制品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚4种黄酮成分的含量，以探讨ADS-7大孔树脂连续使用对苦荞精制品中主要黄酮成分的影响。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

如图1所示，标准曲线的回归方程是：y=0.032 6x-0.009 7，相关系数为 0.999 9。标样浓度与吸光度在4.8～24 mg/L范围内呈良好的线性关系。

图1 AlCl3法标准曲线

2.2 ADS-7大孔树脂使用次数考察

一般认为连续使用的大孔树脂当其吸附率降低30%以上的时候，需要考虑停止使用该树脂或对其进行强化再生处理[16]。根据本实验ADS-7大孔树脂使用结果显示：树脂在连续使用30次后，黄酮吸附量仅降低8.9%，黄酮吸附率降低9.3%（见表1），说明ADS-7大孔树脂在连续使用30次后，吸附苦荞黄酮的性能仍较好。从图2可以看出，ADS-7大孔树脂在连续使用25次以内，黄酮解吸率、洗脱液总黄酮量和总干膏量在一定范围内波动，在使用25次及以后，黄酮解吸率、洗脱液总黄酮量和总干膏量均有一定程度的上升，说明ADS-7大孔树脂在连续使用25次及以后解吸苦荞黄酮的能力增加，洗脱出的黄酮量增多；而总干膏量的增加意味着可能除黄酮以外的杂质也被洗脱出来。

图2 ADS-7大孔树脂连续上样对苦荞黄酮吸附量、吸附率、解吸率、洗脱液总黄酮量及总干膏量的影响

表1 ADS-7大孔树脂使用次数考察

2.3 ADS-7大孔树脂连续使用对苦荞精制品中4种黄酮成分含量的影响

采用HPLC法测定ADS-7大孔树脂连续使用30次所富集的苦荞精制品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚4种主要黄酮成分的含量（见图3）。尽管ADS-7大孔树脂在连续使用25次及以后洗脱液中总黄酮的量及总干膏量有所增加，但洗脱液中4种黄酮的总含量（纯度）在树脂重复使用25次时陡然降低了20.62%，且随后一直维持总体降低的趋势（见表2，图4），进一步证实了ADS-7大孔树脂在连续使用25次及以后洗脱出了除黄酮以外的杂质，且洗脱出的杂质的量相较黄酮的量的增幅更大。苦荞精制品中芦丁和烟花苷含量的变化有类似的趋势（见图4），槲皮素和山奈酚含量的变化随树脂重复使用次数的增加总体呈现逐步降低的趋势（见图4）。考虑到槲皮素和山奈酚在苦荞精制品中的含量较低，对总黄酮含量变化影响不大。因此，综合衡量黄酮吸附量、吸附率、黄酮纯度等指标的检测结果，ADS-7大孔树脂用于富集苦荞黄酮可连续使用至第25次。

图3 大孔树脂连续上样1次、10次、20次、30次苦荞精制品HPLC图

图4 ADS-7大孔树脂连续上样30次对4种黄酮总含量及芦丁、烟花苷、槲皮素、山奈酚含量的影响

表2 ADS-7大孔树脂使用次数对苦荞精制品中4种黄酮成分含量的影响

3 结束语

随着大孔树脂使用次数的增加，一些强吸附性的物质会保留在树脂柱上，吸附的杂质也会越来越多，导致柱效降低，影响目标成分的富集纯化[16-17]。因此，考察大孔树脂的使用次数及其对所吸附成分含量的影响对于目标产品的工业化生产具有重要意义。

一般情况下，大孔树脂在重复使用数次后需要经过酸碱再生处理[16-19]。但采用酸碱处理所需要的溶剂量较大，具有一定的危险性，且酸碱再生后所产生的废液可能对环境造成一定的不良影响[20]。本研究在前期建立ADS-7大孔树脂富集苦荞黄酮工艺方法的基础上，首次考察了ADS-7大孔树脂富集苦荞黄酮的使用次数及对苦荞精制品中4种主要黄酮成分芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚含量的影响。通过综合考虑黄酮吸附量、吸附率、黄酮纯度等指标的检测结果，研究发现以天津浩聚树脂科技有限公司生产的ADS-7大孔树脂用于富集苦荞黄酮可连续使用至第25次，富集过程无需经酸碱再生处理，不仅环保，还可节约生产成本。本研究为苦荞黄酮精制品的规模化生产提供了理论依据和参考。