益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响

刘蔚楠 周晓霞 朱玮 章靓 林家钟 林翔 王荣茂 张燕 戴燕铃

1.福建中医药大学附属人民医院骨伤科，福建 福州 350004

2.福建中医药大学附属人民医院药学部，福建 福州 350004

3.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室(福建中医药大学)，福建 福州 350122

4.福建中医药大学护理学院，福建 福州 350122

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种与增龄相关的疾病，绝经后女性由于雌激素水平迅速下降，成骨与破骨间的动态平衡被打破，出现骨量减少及骨组织结构变化，从而导致PMOP的发生[1]。目前我国人口老龄化日趋严重，是世界上老年人口最多的国家，PMOP已成为我国面临的重要公共健康问题。它会引起全身慢性疼痛、多部位的脆性骨折甚至死亡，严重影响了老年人的生活质量，给个人、家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。目前PMOP的临床用药以西药为主、中药为辅，西医治疗用药主要包括激素替代疗法(HRT)、双膦酸盐、降钙素等。西药在治疗上虽有规范明确的指南，但不少药物都有明显的副作用，如恶心呕吐、头晕乏力、胃肠道不适、激素依赖性肿瘤等，停药后骨量会随之迅速下降[2-5]。

近年来，中医药在防治PMOP方面积累了丰富的临床实践经验，且多数学者[6]认为中药通过对机体多途径、多通路、多靶点的调节，取得了较为肯定的疗效，实现标本同治，在防治PMOP领域具有巨大的潜力。本团队前期临床研究[7-8]表明，益肾健骨膏能够有效减轻PMOP患者的疼痛，提高腰椎骨密度，降低Ⅰ型胶原蛋白C端肽水平，且未出现胃肠道不良反应，但其相关作用机制尚不明确。因此，本研究拟用益肾健骨膏干预去势大鼠，探讨益肾健骨膏对改善PMOP骨密度和骨代谢的效果及其潜在作用机制，为临床应用提供进一步的理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：清洁级雌性SD大鼠50只，3月龄，体重(250±20)g，购自福建医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(闽)2016-0002，饲养于福建省中医药科学院比较医学中心，温度22 ℃～24 ℃，湿度40 %～70 %，每日人工光源12 h明暗交替。本实验经福建省中医药研究院动物伦理委员会批准(批号：FJATCM-IAEC2020004)

1.1.2药品：阿仑膦酸钠维D3购自石药集团欧意药业有限公司，批号271190202；注射用青霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司，批号10122008163；益肾健骨膏(批号：200727)，由福建中医药大学附属人民医院制剂室提供，主要组成：杜仲、淫羊藿、菟丝子、黄精、骨碎补、当归、熟地、巴戟天、补骨脂、枸杞、山药等，水煎过滤，浓缩至500 mL药液(每毫升相当于1.3 g原生药的药液)，即高剂量膏方组浓度。低剂量膏方组取益肾健骨膏药液100 mL加水稀释至600 mL(每毫升相当于0.2 g原生药的药液)。

1.1.3主要试剂和仪器：主要试剂：戊巴比妥钠(Sigma公司，批号AM00469)，RNA提取液(Thermo，货号15596026)，反转录试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司，货号E047-01B)，QPCR试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01A)，Notch1 (D1E11) XP Rabbit mAb(CST公司，货号3608)，Notch2 (D76A6) XP Rabbit mAb(CST公司，货号5732)，Jagged2 (C23D2) Rabbit mAb(CST公司，货号2210)，Jagged1 Polyclonal Antibody(immunoway公司，货号YT6212)，耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨保护素(OPG)、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTX-Ⅰ)检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，货号: SEA902Ra、SEA108Ra、CEA957Ra、CEA665Ra)；主要仪器：双能X射线骨密度仪(美国HOLOGIC，型号：DISCOVERY W型)、荧光定量PCR仪(ABI公司，型号：Stepone plus)、(450±10)nm滤光片的酶标仪(BioTek公司，型号ELx808)、万能材料试验机(日本岛津公司IG-A1000 N)。

1.2 方法

1.2.1动物造模及分组、给药：50只3月龄雌性SD大鼠喂养2个月后，随机分为假手术组、模型组、高剂量膏方组、低剂量膏方组、阳性药物组,每组10只。禁食12 h后经大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，假手术组大鼠暴露卵巢但不切除，其余各组大鼠采用一次性切除双侧卵巢的方法造模[9]，术后连续3 d给予8万U青霉素预防感染。造模成功后，假手术组、模型组给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，低、高剂量膏方组分别给予2 g/(kg·d)、13 g/(kg·d)益肾健骨膏灌胃，阳性药物组灌服6.25 mg/(kg·w)阿伦膦酸钠维D3片[10]，各组均持续干预12周。每周记录大鼠的体重，根据体重调整灌胃量。实验结束时，假手术组死亡1只，其他组大鼠均存活。

1.2.2取材：干预12周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，用2 %戊巴比妥钠(45 mg/kg)经大鼠腹腔注射麻醉后，取腹主动脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min，取血清，保存于-80 ℃冰箱备用。分离大鼠L4、L5腰椎，用生理盐水湿润的纱布包裹，外层再予锡纸包好后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3大鼠腰椎骨密度、最大压缩载荷测定：采用骨密度仪检测腰椎L4的骨密度，选择高分辨模式，行间距0.07 cm，点分辨率为0.062 2 cm，6.10×0.10 Coll，140/100 kVp。万能材料试验机对腰椎L4进行椎体压缩(加载速度为1 mm/min)，记录最大压缩载荷。

1.2.4血清骨代谢指标检测：大鼠腹主动脉采血，以3 000 r/min离心15 min，取上层血清，Elisa法检测血清TRACP、OPG、PINP，CTX-Ⅰ水平。

1.2.5PCR法检测Notch通路及OPG/RANKL/RANK系统的基因表达：用液氮研磨冻存的大鼠L5腰椎组织，按照试剂盒依次提取总RNA，反转录及扩增，实时荧光定量PCR法检测OPG、RANKL、RANK、TRAF 6、Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的 mRNA表达。引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，详见表1。DNA扩增条件：95 ℃预变性10 min后进入PCR循环，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共40个循环。结果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.6Westbern blot检测骨组织Notch通路的蛋白表达：将50 mg腰椎组织加入液氮研磨，提取总蛋白，上样电泳后转至PVDF膜上，室温封闭2 h，分别加入稀释的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2一抗(1∶1 000), 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后3次,加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜后,ECL显影曝光，Photoshop整理去色，Image J软件分析条带的灰度值。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠腰椎最大压缩载荷及骨密度的影响

与假手术组比较,模型组大鼠腰椎压缩最大载荷及骨密度显著降低(P<0.05)；与模型组比较，低剂量膏方组腰椎压缩最大载荷及骨密度变化无统计学意义(P>0.05)，而高剂量膏方组和阳性药物组显著升高(P<0.05)，高剂量膏方组和阳性药物组在腰椎压缩最大载荷及骨密度方面接近，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图1。

表2 各组大鼠腰椎压缩最大载荷及骨密度Table 2 The maximum compressive load of lumbar spine and bone mineral density of the rats in each group

2.2 益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢标志物的影响

与假手术组相比,模型组大鼠TRACP、CTX-Ⅰ水平显著升高，而PINP、OPG水平显著降低(P<0.05)；治疗3个月后，与模型组比较，低剂量膏方组骨代谢物水平无明显变化(P>0.05)，而高剂量膏方组和阳性药物组TRACP、CTX-Ⅰ水平显著降低，而PINP、OPG水平显著升高(P<0.05)；高剂量膏方组和阳性药物组TRACP和OPG水平无明显差异(P>0.05)，高剂量膏方组CTX-Ⅰ水平高于阳性药物组，而PINP低于阳性药物组(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠血清PINP、OPG、TRACP、CTX-Ⅰ水平Table 3 The serum levels of PINP, OPG, TRACP and CTX-Ⅰ in each

2.3 益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Notch通路的影响

与假手术组相比,模型组大鼠腰椎Notch 1、Notch 2及其配体Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，低剂量膏方组、高剂量膏方组和阳性药物组Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05)，见表4和图2。

表4 各组大鼠Notch 1、Notch 2、Jagged 1 and Jagged 2基因表达Table 4 Relative mRNA levels of Notch 1, Notch 2, Jagged 1 and Jagged 2 in each

2.4 益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠OPG/RANKL/RANK系统基因表达的影响

与假手术组比较,模型组大鼠腰椎OPG的mRNA表达显著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表达显著增加(P<0.05)；与模型组比较，低剂量膏方组OPG的mRNA表达无明显变化(P>0.05)，RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表达显著减少(P<0.05)；与模型组比较，高剂量膏方组和阳性药物组腰椎OPG的mRNA表达显著增加(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表达显著降低(P<0.05)；与高剂量膏方组比较，阳性药物组腰椎OPG的mRNA表达显著增加(P<0.05)，RANKL、RANK的mRNA表达无显著差异(P>0.05)，下游TRAF 6的mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠OPG/RANKL/RANK系统基因表达Table 5 Relative mRNA expression levels of OPG/RANKL/RANK in each

3 讨论

中医学将绝经后骨质疏松症归属为“骨痿”范畴，主要是由于绝经后女性肾精不足导致骨失滋养的全身性慢性骨骼疾病。中医认为，PMOP的关键病机以肾精亏虚为主，兼顾脾虚和血瘀，临床治疗以“改善临床症状，延缓骨量丢失，或增加骨量，降低骨折风险，提高生存质量”为目的，遵循补肾益精、健脾益气、活血祛瘀的基本治则[6]。近年来研究[11]显示，中药治疗PMOP主要表现为类雌激素样作用，能有效提高雌激素，抑制骨吸收，促进骨形成，从而达到防治PMOP的疗效。目前疗效较为明确的单味中药包括杜仲、骨碎补、淫羊藿、补骨脂、葛根、丹参等，中成药有左归丸、金天格胶囊(肝肾阴虚证)，右归丸、仙灵骨葆胶囊(脾肾阳虚证)，骨疏康颗粒/胶囊、壮骨止痛胶囊(肾虚血瘀证)[6,12]。流行病学调查[13]显示，PMOP的中医证型肾虚证高达84.7 %，治疗PMOP的药物归经主要以肝肾居首。近年来多项系统评价[14-16]显示补肾法是治疗PMOP的根本大法，补肾中药可以改善PMOP患者的VAS评分、骨密度、骨代谢以及脆性骨折发生率等指标，其临床疗效确切，且无不良事件。

益肾健骨膏为福建中医药大学附属人民医院治疗骨质疏松症的经验方，现已作为协定成方广泛应用于临床。益肾健骨膏以“补益肝肾、活血化瘀”为组方原则，方中杜仲、续断、骨碎补、巴戟天具有补肝肾、强筋骨的作用，加用菟丝子、山茱萸、枸杞、黄精可增强补益肝肾的作用，佐以当归、熟地、丹参、牛膝可活血化瘀、益精填髓。益肾健骨膏诸药合用共奏补益肝肾、强筋壮骨、活血通络之效，使骨有所充、髓有所化、筋有所养。且“滋膏”的剂型是治疗慢性疾患的最佳剂型，适合PMOP患者长期滋补服用。本研究结果表明，高剂量的益肾健骨膏可以显著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨强度及骨形成指标，且降低骨吸收指标水平，与前期临床研究结果一致，再次证实益肾健骨膏在调节PMOP骨代谢水平，促进骨重建方面的显著疗效。

Notch信号通路骨代谢和骨重建方面发挥着关键作用, 可影响成骨细胞和破骨细胞的分化和平衡，是治疗绝经后骨质疏松症的新靶点[17-18]。Canalis E[19]的研究表明，骨细胞中Notch1表达显著增加了小鼠血清OPG的含量，以抑制骨吸收引起骨量的增加。多项中医补肾方干预PMOP大鼠后显示，对Notch通路的Notch 1、Jagged 1、HES蛋白表达起正向调节作用,促进骨形成,改善了PMOP的症状[20-22]。本研究显示，PMOP模型大鼠的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA、蛋白表达均显著降低，益肾健骨膏治疗后，上述基因的mRNA、蛋白表达显著升高，说明益肾健骨膏可能通过影响Notch通路，促进骨形成，抑制骨吸收，进而减少骨量丢失。

OPG/RANKL/RANK轴与PMOP的发生密切相关，它是雌激素受体激活通路的下游信号通路，OPG是抑制骨吸收、增加骨密度和骨强度的关键细胞因子。OPG与RANKL分别作用于OC和OB，OPG通过与RANK竞争性地结合RANKL起到调控骨代谢信号通路的作用。若OPG/RANKL/RANK信号表达失衡，则破骨活性增强，形成负性骨平衡状态而导致PMOP的发生[23-24]。高城翰等[14]的Meta分析表明补肾法在调节PMOP动物模型的OPG/RANK/RANKL信号通路方面具有重要优势。本研究结果显示，PMOP模型大鼠腰椎OPG的mRNA表达显著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表达显著增加，而高剂量益肾健骨膏干预后，大鼠腰椎OPG的mRNA表达显著增加，同时RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表达降低，提示益肾健骨膏可能通过OPG/RANKL/RANK轴抑制了骨吸收，减少骨量丢失。

综上所述，基于“补益肝肾、活血化瘀”治疗原则组方的益肾健骨膏，能够有效增强去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度和骨强度，调节骨形成和骨吸收的代谢平衡，其作用机制可能与干预了Notch通路及OPG/RANKL/RANK系统密切相关，为临床应用提供了进一步的理论支持。