葛根中内源性组分葛根素的生物效应

郭 娴，郭 岚，徐梦佳，陈锦萍，万益群

(南昌大学化学学院，江西 南昌 330031)

葛根(RadixPueraria)，又名甘葛、粉葛、葛藤等，是豆科植物葛的块根。我国是葛类植物的主要生产地，资源丰富，主要分布在湖北、湖南、山西等地区[1-2]。葛根是一种常用的中药，味甘性凉。据《本草纲目》记载：“葛根乃阳明经药，兼入脾经，脾主肌肉......野葛性甘、辛、凉。有解肌退热，透渗，生津止渴，升阳止泻之功。常用于表证发热，项背强痛，麻瘆不透，热病口渴，阴虚消渴，热泻热痢，脾虚泄泻”[3-4]。现代药理研究表明，葛根具多重生物活性，如抗炎[5]、降血压[6]、降血糖[7]、抗肿瘤[8]以及抗氧化等作用[9]。有研究表明,葛根中主要含有葛根苷、香豆素、生物碱、三萜类化合物、氨基酸以及异黄酮类化合物等组分[10-11]，其中以异黄酮类物质含量最多，主要包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等。在日常生活中，葛根也可作为食品来使用。

随着葛根的广泛应用，其安全性也受到人们的广泛关注，有关其不良反应的报道逐渐增多。张玲[12]等人对国内1994年以来关于葛根素注射剂所导致溶血反应的27篇病例报道中的48例病人进行分析，发现溶血反应多发生于以往曾用过葛根素或连续用药一周以上的病人，以急溶血性贫血为主要表现，血液免疫学检查可见葛根素特异性抗体。许焱[13]等人研究发现，葛根素可导致急性肾衰竭，其机制可能为多方面的，但主要为肾小管坏死，与此同时，免疫复合物在肾脏沉积诱发炎症反应引起肾小球及肾间质损伤，也可能同时使肾衰竭加重。朱玉珍[14]等在一例葛根素注射液引起急性溶血和肾衰竭的病例中，分别做了直接、间接抗球蛋白实验，实验结果显示，葛根素进入体内后与组织细胞膜松散结合，形成一种异己抗原，使敏感个体产生相应的药物抗体，病人红细胞严重受到损害。我国食品药品监督管理局在2004年11月发布了“关于修订葛根素注射剂说明书的通知”，要求相关企业尽快修订说明书和包装标签，并要求生产企业、医生和患者高度重视葛根素引起的严重不良反应等[15]。因此，系统地研究评估葛根中的主要组分葛根素的毒性，对合理食用葛根具有重要的指导意义。

本文以Balb/c小鼠作为实验动物，根据《中国药典》2020年版规定，葛根中主要功效成分为葛根素，且含量不得少于2.4%，成年人每日葛根临床用量约为10-15 g，即每公斤体质量成人对葛根素的摄入量约为4～6 mg[4]。以成人对葛根素的最大摄入量为基准，小鼠与人体表面积折算系数约为9.01[16]来确定给药剂量，通过急性经口毒性实验，探究一定剂量的葛根素对小鼠的主要脏器(包括肝脏、肾脏、心脏)的影响，为正确使用葛根提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

葛根素(AR，95%)购自上海源叶生物公司；谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、总胆红素(Total Bilirubin,T-BIL)、间接胆红素(Indirect Bilirubin,I-BIL)、直接胆红素(Direct Bilirubin,D-BIL)、肌酐(Creatinine,CREA-J)、尿酸(Uric Acid,UA)、尿素(Urea,UREA)、乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)、羟丁酸脱氢酶(Hydroxybutyric Dehydrogenase,HBDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme,CK-MB)等试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；二甲苯、盐酸和氨水(AR)购自国药集团化学试剂有限公司；10%福尔马林中性固定液购自雨露实验器材有限公司；聚乙二醇400(PEG 400，AR)购自天津恒兴试剂有限公司；苏木素-伊红染液购自武汉市皮诺飞生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

GL-21M型冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；BS-380型全自动生化分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；JJ-12J型脱水机、JB-P5型包埋机和JB-L5型冻台均购自武汉俊杰电子有限公司；RM2016型病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司；KD-P型组织摊片机购自金华市科迪仪器设备有限公司；10212432C型载玻片及盖玻片购自江苏世泰仪器制造有限公司；NIKON ECLPSE CI型正置光学显微镜和NIKON DS-U3型成像系统均购自日本尼康有限公司。

1.3 实验动物

健康级Balb/C种小白鼠，雌雄各半，4～6周龄，体重(20±2)g，由南昌市乐悠生物科技有限公司提供。在试验前所有小鼠均适应环境7 d，温度控制在(24±2)℃，相对湿度为55%±10%，自由饮水进食，光照条件为12 h白昼，12 h黑夜。

1.4 方法

1.4.1 毒性评估实验

健康级Balb/C小鼠20只，按性别、体重随机分为2组，即为对照组和给药组，每组10只，雌雄各半，雌雄分笼饲养。给药组灌胃葛根素，剂量为6000 mg·kg-1，对照组灌胃等体积的聚乙二醇 400(PEG 400)。以上各组小鼠均按体质量10 mL·kg-1灌胃一次。小鼠在给药前禁食不禁水12 h，给药后常规饲养，持续观察7 d。每天观察小鼠的饮食情况、毛色状况、精神状态等一般行为，并记录小鼠的体重。若小鼠出现死亡情况，将立即对小鼠进行解剖，并肉眼观察小鼠主要脏器病理形态变化。7 d后对小鼠进行眼眶静脉丛处取血并处死，血液进行生化分析，分离完整的心脏、肝脏和肾脏，用生理盐水清洗后滤纸吸干，进行称重，然后将组织固定在10%福尔马林中性固定液中，进行组织病理学研究。

1.4.2 小鼠血清分析

各组小鼠在实验第7 d后禁食不禁水12 h处死。经小鼠眼眶静脉丛取血，待血液静置1 h后于4℃、3000 r·min-1的条件下离心。分离的血清样本用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)、间接胆红素(I-BIL)、尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA-J)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和羟丁酸脱氢酶(HBDH)等生化指标的含量。

1.4.3 组织病理学研究

小鼠取血后脱颈处死并解剖，取出其心脏、肝脏、肾脏，并肉眼观察有无异常变化。在称重后用10%福尔马林固定液固定24 h以上后进行脱水、包埋、切片、苏木素伊红(HE)染色，在光学显微镜下进行病理学形态研究。

1.4.4 统计学分析

应用SPSS26.0版统计软件对实验数据进行分析，各组计量数均以¯X±S表示，采用单因素方差分析考察其显著性，组间进行两两比较，采用LSD方法，以P<0.05为差异具有统计学意义，以P<0.01为差异非常显著。

2 结果与讨论

2.1 小鼠体质量的影响

对小鼠饮食和活动情况进行了观察。对照组和给药组有若干只小鼠在灌胃后当天出现行动迟缓、炸毛等症状，且在4 h后症状消失，其他小鼠未出现异常症状，且在7 d观察期内，未出现小鼠死亡情况，并且各小鼠进食饮水、毛色状态和行动状况均正常，说明葛根素对小鼠的一般生长情况没有较大影响。

在实验期间对小鼠进行了称重，并对各组数据进行了统计分析，结果见表1。结果表明，与对照组比较，给药组小鼠在灌胃葛根素前后体质量未出现显著性差异(P>0.05)，表明葛根素对小鼠正常的生长情况无影响。

表1 葛根素对小鼠体重变化的影响(n=5)

2.2 小鼠主要脏器指数的影响

脏器指数是小鼠脏器与体重的比值，当小鼠脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。因此本实验对各组小鼠的主要脏器指数进行了分析，结果见表2。结果表明，与对照组相比，给药组小鼠的心脏、肝脏、肾脏指数均无显著性差异(P>0.05)，表明葛根素对小鼠脏器指数无明显影响。

表2 葛根素对小鼠脏器指数变化的影响(n=5)

2.3 小鼠肝功能、肾功能和心功能的影响

对小鼠血清的各生化指标(包括肝功能、肾功能和心功能指标)按1.4.2方法进行分析。结果表明，与对照组小鼠比较，给药组雌性小鼠尿素(UREA)含量由5.80显著上升至 6.93 mmol·L-1(P<0.05，见图1-a)；给药组雌雄小鼠心脏生化指标LDH水平由472.60和520.60 U·L-1分别下降至411.15和 300.21 U·L-1(P<0.01，见图1-b)；给药组雄性小鼠血清中HBDH含量由193.60显著下降为130.01 U·L-1(P<0.01，见图1-c)；而其他各生化指标值与对照组相比均没有显著的差异。因上述结果表明，当小鼠灌胃该实验剂量的葛根素后，小鼠的一些肾功能指标和心功能指标会发生一些变化。

注：*表示与对照组之间具有显著性差异(P<0.05)；#表示与对照组之间差异十分显著(P<0.01)。

2.4 小鼠脏器组织病理分析

对小鼠的脏器(包括肝脏、心脏和肾脏)按1.4.3方法进行处理，并进行病理学形态研究，结果见图2-图4。由图2可见，对照组雌雄小鼠的肝脏和给药组雌雄小鼠的肝脏均呈现一定程度的嗜酸性变，因此相比对照组小鼠肝脏而言，给药组雌雄小鼠肝脏基本没有受到损伤；由图3可见，给药组雌雄小鼠心脏除存在局灶嗜酸性变外还伴有部分心肌溶解，周围心肌细胞坏死；由图4可见，对照组雌雄小鼠肾脏存在少许嗜酸性变，而给药组雌雄小鼠存在局灶嗜酸性变和肾小管间质局灶性出血。以上病理学形态分析结果表明，该实验剂量的葛根素对小鼠的肝脏几乎不产生影响，而对小鼠的心脏和肾脏均有一定程度的影响。

a-对照组雄性；b-对照组雌性；c-给药组雄性；d-给药组雌性。

a-对照组雄性；b-对照组雌性；c-给药组雄性；d-给药组雌性。

a-对照组雄性；b-对照组雌性；c-给药组雄性；d-给药组雌性。

3 结论

对小鼠一次性灌胃剂量为6000 mg·kg-1葛根素后，各组小鼠一般活动状态良好，且未出现死亡。进一步对小鼠血清的各生化指标进行分析，结果表明，雌性小鼠的肾脏生化指标UREA水平显著低于对照组雌性小鼠，且给药组雄性小鼠心脏生化指标LDH、HBDH和雌性小鼠的LDH值与对照组相比显著降低。对小鼠心脏、肝脏和肾脏进行组织病理学分析，结果显示该剂量的葛根素对小鼠心脏及肾脏具有较轻微影响。因此，本文实验剂量6000 mg·kg-1为大于葛根临床剂量的100倍。由实验结果可知，此剂量下葛根素的摄入量对人体健康没有影响。以上研究结果为葛根素进一步慢性毒性实验提供了重要的实验依据，并为指导人们安全使用葛根提供了一定的理论依据。