独脚金内酯对蜜环菌生长的影响*

许存宾，张建昆，孟 攀，田 野，蔡 菊，朱国飞

（贵州理工学院，贵州 贵阳 550003）

独脚金内酯（strigolactones，SLs） 是来源于植物类胡萝卜素代谢途径的一类萜类小分子化合物，是近年发现的能调控植物生长发育的新型植物激素[1]，并且还能分泌到根外影响根系周围土壤微生物的生长[2-3]。独脚金内酯最初是在研究寄生杂草独脚金（Striga spp.）的种子萌发信号物质时，在寄主棉花的根际分泌物中被发现的[4]。目前已在植物中鉴定出约36种天然独脚金内酯化合物，并人工合成了多个类似物[5]。独脚金内酯在植物中的合成途径和功能已被广泛研究，其能影响植物分枝、分蘖、叶片发育、株高、花青素合成、根系生长以及抗逆性等[6-8]。独脚金内酯对微生物生长的影响在丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）中研究较多，其能促进丛枝菌根真菌的孢子萌发、菌丝分枝、线粒体代谢及与植物共生关系的形成[9]，从而促进丛枝菌根和植物的生长，但是独脚金内酯具体如何影响丛枝菌根分枝的分子调控机制仍不清楚。独脚金内酯还对部分植物病原真菌[10-11]、内生菌[12]产生影响，但表现形式并不统一，可能促进菌丝生长和分枝，也可能抑制菌丝生长和分枝[10]。

蜜环菌（Armillaria mellea） 是传统的食药兼用真菌，与名贵药用植物天麻为共生关系，能为天麻生长提供营养物质[13]，同时其本身也具有与天麻相似的药理作用。Yuan等[14]发现独脚金内酯能促进蜜环菌形成分枝，黄靖雯等[15]发现独脚金内酯能促进高卢蜜环菌（Armillaria gallica） 形成分枝，且认为几丁质酶可能参与了蜜环菌分枝的形成。但目前关于独脚金内酯对蜜环菌生长的影响报道仍较少。蜜环菌的分枝及生长情况能影响药用植物天麻的生长和产量，通过分析独脚金内酯GR24对蜜环菌的分枝数、菌丝干质量及多糖产量的影响，为独脚金内酯在蜜环菌或天麻生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种

蜜环菌菌株A9，为蜜环菌液体深层发酵和天麻人工栽培生产中的常用菌种，购于华中农业大学应用真菌研究所。

1.1.2 化学试剂

将独脚金内酯GR24（上海源叶生物科技有限公司）用丙酮溶解，配制成质量浓度为0.1 mg·mL-1的储备液。将储备液进行稀释，制备质量浓度为0.01 mg·mL-1的工作液。

丙酮、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、KH2PO4、MgSO4、NaCl均为分析纯 （AR）。

1.1.3 培养基及配方

市售玉米粉、菜籽饼，琼脂粉、酵母浸粉均为生物试剂（BR）。共使用3种培养基，配方见表1。

如表1所示，PDA培养基为蜜环菌培养基础培养基；玉米粉-菜籽饼液体培养参照陈伟[16]的研究结果；玉米粉-酵母浸粉液体培养基将玉米粉-菜籽饼培养基中的菜籽饼替换为酵母浸粉，以改进菜籽饼颗粒不易从菌丝体上分离的问题。

表1 培养基配方Tab.1 Medium formulation

1.2 蜜环菌培养

1.2.1 固体培养基培养

无菌条件下，分别向灭菌冷却后尚未凝固的PDA培养基中分别添加GR24工作液，使其最终质量浓度为 0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1，以及单独添加 30 μL 丙酮（CK），各处理混匀后倒板。分别接种经PDA培养基活化的蜜环菌（取长度为5 mm的菌索） 于培养皿中央，置于25℃条件下恒温培养，定期观察并记录，每个处理3次重复。

1.2.2 液体培养基培养

无菌条件下，分别向灭菌冷却后的液体培养基中添加GR24工作液，使其最终质量浓度为0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1。接种经PDA培养基活化的蜜环菌（取长度为5 mm的菌索），置于25℃、121 r·min-1条件下振荡培养，定期观察并记录，每个处理3次重复。

1.3 蜜环菌菌索计数与分枝率计算

分别在培养11 d、14 d、17 d、20 d对培养皿内肉眼可观察到的菌索进行统计，得到菌索总数；再对菌索上出现分枝的菌索进行计数，得出分枝菌索数。蜜环菌菌索分枝率（R，%）的计算公式为：

式中：Nb为分枝菌索数（个）；Nt为菌索总数（个）。

1.4 蜜环菌菌丝干质量的测定

测定固体培养的蜜环菌菌丝干质量：将固体培养基融化后用蒸馏水洗涤菌丝，获得无培养基残留的菌丝置于培养皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

测定液体培养的蜜环菌菌丝干质量：将液体培养的蜜环菌通过20目标准检验筛，用100 mL蒸馏水洗涤菌丝球；将滤液再次通过100目标准检验筛，用50 mL蒸馏水洗涤菌丝球。将2次过滤所得菌丝球置于培养皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

1.5 蜜环菌多糖的测定

蜜环菌多糖的测定方法参考张琦等[17]的苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准物质测定标准曲线，以上述培养获得的干菌丝为样品进行多糖含量的测定。

1.6 数据分析

试验数据使用Microsoft office 2019软件整理，GraphPad Prism软件进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 GR24对蜜环菌生长和分枝的影响

通过在PDA培养基中添加不同浓度独脚金内酯GR24后培养蜜环菌，培养11 d、14 d、17 d和20 d时观察其生长情况，结果见图1。

图1 不同GR24质量浓度对蜜环菌生长和分枝的影响Fig.1 Effect of different mass concentrations of GR24 on Armillaria mellea growing and branching

如图1A所示，GR24能显著增加蜜环菌分枝，菌索两侧产生大量毛刺状凸起。

如图1B和1C所示，菌索总数与分枝菌索数的变化情况基本一致。添加GR24质量浓度为1 μg·L-1时，菌索总数和分枝菌索数最少，且均低于对照组（CK）；而后随GR24添加量的增加，促进了蜜环菌的生长，且当质量浓度为2 μg·L-1时，培养11 d的蜜环菌菌索和分枝菌索的数量均已显著超过对照组（CK）；GR24 在低质量浓度时抑制生长、2 μg·L-1时促进生长的结果，与Dor Evgenia[10]研究独脚金内酯对根部病原菌生长影响的结果相一致。当GR24质量浓度为2.5 μg·L-1时，培养前期蜜环菌生长速度较慢，培养20 d后其菌索总数和分枝菌索数达到最大值；这可能是因为GR24在培养基内发生了消耗或降解，时间延长后降低至蜜环菌生长的最适浓度。另外，使用丙酮处理的对照组（CK）中菌索总数略少于GR24质量浓度为0的试验组，但两者之间无显著差异性。

如图1D所示，添加GR24后分枝率显著增加。其中，当质量浓度为2.0 μg·L-1时，统计不同培养时长的蜜环菌分枝率均为最高。但不同质量浓度的独脚金内酯对真菌生长和分枝的影响仍存在很大区别[18]，因为独脚金内酯是脂溶性分子，在不同溶剂和培养基介质的溶解、扩散等存在差异，这也导致同一处理中菌索生长数据离散性加大。

综合分析显示，GR24在低质量浓度（＜2.0 μg·L-1）以及高质量浓度（＞2.0 μg·L-1）下均会抑制蜜环菌菌索生长，但能促进其菌索分枝的形成。这与前期报道的独脚金内酯对AM真菌、植物病原真菌的结果相一致[9-11]；当独脚金内酯GR24的质量浓度为2.0 μg·L-1时，既可促进菌索生长，又可提高蜜环菌的分枝菌索数和分枝率。

2.2 GR24对蜜环菌菌丝球形态的影响

使用添加GR24的玉米粉-菜籽饼液体培养基培养的蜜环菌菌丝体见图2。

如图2所示，使用液体培养基培养的蜜环菌菌丝体呈球形，添加不同质量浓度的独脚金内酯GR24对菌丝球的大小有显著的影响。添加独脚金内酯GR24后形成的菌丝球直径均大于不添加的处理；其中GR24质量浓度为1.0 μg·L-1的培养液中形成的菌丝球直径最大，但数目最少。此外，使用添加不同质量浓度GR24的玉米粉-酵母浸粉液体培养基培养蜜环菌，其菌丝球生长情况与前者相似。因此，推测独脚金内酯能增加蜜环菌液体培养菌丝球的大小，可能是其可促进蜜环菌分枝，分枝缠绕易形成大的菌丝球。

图2 不同GR24质量浓度的玉米粉-菜籽饼液体培养基中的蜜环菌菌丝球Fig.2 Mycelium pellets of Armillaria mellea in liquid media of cornmeal-yeast extract powder with different mass concentrations of GR24

2.3 GR24对蜜环菌菌丝干质量的影响

对PDA固体培养基中培养20 d的蜜环菌和玉米粉-酵母浸粉液体培养基中培养18 d的蜜环菌菌丝干质量进行测定，结果见图3。

图3 不同GR24质量浓度对蜜环菌菌丝干质量的影响Fig.3 Effect of GR24 on dry weight of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如图3所示，随着GR24质量浓度的升高，固体和液体培养基中蜜环菌的菌丝干质量均呈现先下降后上升的趋势；在GR24质量浓度为2 μg·L-1时菌丝干质量达到最大，而后又降低。这与GR24对菌索数量的影响结果一致，低质量浓度对蜜环菌的生长有抑制作用，当质量浓度为2 μg·L-1时则促进其菌生长。

2.4 GR24对蜜环菌多糖含量的影响

试验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖作为标准物质，得到的葡萄糖标准液线性回归方程为：

该回归方程的相关系数R2为0.999 1。

取玉米粉-菜籽饼液体培养基与玉米粉-酵母浸粉液体培养基培养20 d的蜜环菌菌丝，烘干后测定其多糖含量，因获得的菌丝较少，取3个重复混合后进行测定，结果见图4。

图4 不同GR24质量浓度对蜜环菌菌丝多糖含量的影响Fig.4 Effect of GR24 on the polysaccharide content of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如图4所示，随着GR24质量浓度的升高，2种液体培养基中蜜环菌菌丝的多糖含量逐渐增加，在GR24质量浓度为2.0 μg·L-1时多糖含量达到最大值，随后开始下降。玉米粉-酵母浸粉培养基中菌丝多糖的含量略高于玉米粉-菜籽饼培养基中菌丝多糖的含量，这为后期开展蜜环菌液体培养的培养基选择提供一定参考。蜜环菌多糖是其药用成分之一，具有一定抗肿瘤、抗惊厥和降血脂等药理活性[19-20]，添加独脚金内酯能增加蜜环菌多糖含量，对蜜环菌液体发酵和开发应用具有一定的指导意义，但独脚金内酯促菌丝多糖含量增加的机制有待进一步研究。

3 讨论与结论

独脚金内酯作为一种新型植物激素，既能调控植物生长发育，还能影响相关微生物的生长。蜜环菌是药用植物天麻的共生菌，为其生长提供营养物质和能量，因此探究了不同质量浓度的独脚金内酯GR24对蜜环菌生长的影响。研究发现，独脚金内酯能显著影响蜜环菌菌丝分枝，这与Yuan等[14]的发现一致，低质量浓度的独脚金内酯（1.0 μg·L-1）能快速促进蜜环菌分枝，高质量浓度（2.0 μg·L-1）在长期促进蜜环菌分枝方面更显著，但质量浓度过高可能会抑制蜜环菌分枝。独脚金内酯可提高蜜环菌菌丝干质量，质量浓度为2.0 μg·L-1时菌丝干质量增加最为显著。独脚金内酯能促菌丝体形成的菌丝球直径增大，这可能与其促进蜜环菌分枝从而菌丝更易相互缠绕有关。此外，还发现独脚金内酯能促进蜜环菌多糖的形成，当质量浓度为2.0 μg·L-1时促进作用最佳。

独脚金内酯能显著影响蜜环菌的生长发育，为调控蜜环菌和天麻的生产提供新的思路；且蜜环菌培养方便，为研究独脚金内酯与真菌之间的作用机制提供新的研究材料。早期对独脚金内酯影响土壤微生物的研究集中在丛枝菌根真菌，认为独脚金内酯会通过激活线粒体[21]、激发ROS相关基因表达[11]等分子机制促进真菌分枝，但由于丛枝菌根真菌难培养、多核且无法建立遗传转化体系而难于开展深入研究；也有部分研究者将研究对象转向植物病原真菌[11]；而蜜环菌-天麻的共生模式与丛枝菌根真菌-植物的共生模式更为相似，更有利于开展独脚金内酯调控真菌生长的分子机制研究。此外，目前关于蜜环菌-天麻之间的共生机制仍有很多问题尚未解决，独脚金内酯可能是影响两者共生关系的调节因素，为开展共生机制研究提供新的方向。通过阐述独脚金内酯对蜜环菌生长的影响，为利用独脚金内酯提高蜜环菌和天麻的产量提供理论基础，但其作用机制和应用方式仍有待进一步研究。