梯棱羊肚菌单孢菌株田间混合栽培出菇试验*

贺国强

（北京市农业技术推广站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）属于黑色羊肚菌类群，隶属于子囊菌门（Ascomycota） 盘菌纲（Pezizomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchel laceae） 羊肚菌属（Morchella），营腐生营养类型，属于羊肚菌中可驯化的主要品种之一[1]，目前已实现大规模栽培。梯棱羊肚菌子囊孢子发育过程的核行为观察分析表明，梯棱羊肚菌的子囊孢子虽为多核体，但其细胞核均是来自早期减数分裂后进行有丝分裂形成的8个细胞核中的1个，因而其子囊孢子为同核体[2]。通过分析交配型基因，已证明梯棱羊肚菌为异宗结合真菌[3-5]。其每个单孢含有1种交配型基因（MAT1-1-1或MAT1-2-1），且2种不同交配型基因的相互作用可能是完成生活史所必须的。这为不同交配型菌株间的杂交出菇提供了遗传基础。

目前栽培羊肚菌普遍采用组织分离获得菌种，但组织分离、转代次数等因素会导致羊肚菌菌株其中1种交配型基因逐渐减少或衰退[6-7]，无法完成有性生殖的过程，从而无法出菇。此外，羊肚菌交配型基因预测出菇还仅停留在实验室阶段。担子菌的杂交育种通常可以以单孢之间拮抗线的锁状联合为标记，但羊肚菌属于子囊菌，菌丝无明显的锁状联合，难以从实验室阶段得出是否杂交成功的结论。羊肚菌基因型的鉴定已经是较为成熟的技术手段，因此，通过将不同基因型的羊肚菌制成单孢固体菌种，再于田间混合播种，可直接观测结果，极大地方便了羊肚菌田间杂交育种。

通过显微操作法分离梯棱羊肚菌亲本菌株，收集得到其单孢群体并测定单孢群体的交配型，随后对单孢群体间进行田间条件下的随机配对杂交，筛选得到优势组合和含有2种交配型基因的菌株，以期为羊肚菌育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及仪器、试剂

梯棱羊肚菌栽培菌株M-Y15、M-CY、M-HM为亲本菌株（F0），源自商业化栽培菌株和野生驯化菌株，保存于北京市农业技术推广站食用菌实验室。采用形态学特征结合ITS序列分析确证是梯棱羊肚菌。利用自然弹射法收集羊肚菌的子囊孢子。

VS-1300L-U超净工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-70生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；S1000PCR仪，美国伯乐公司；JY-SP5电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；JY04S-3B凝胶成像仪，北京君意东方电泳设备有限公司。所用试剂包括PDA培养基，Oxoid公司；Tris，赛默飞世尔科技公司；HCl、EDTA、苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇，购自国药集团；ddH2O，天根生化科技（北京）有限公司等。

1.2 单孢分离及纯化

采用显微操作技术分离羊肚菌单个子囊孢子，分离方法参照参考文献[8]。将羊肚菌孢子用无菌的20%甘油水溶液悬浮，然后在40倍显微镜视野下用毛细管挑针吸住分散的单个子囊孢子，抬针，将吸取的子囊孢子在无菌操作环境下转移（小洗耳球吹出） 至PDA培养基平板，置于23℃避光培养，约36 h～48 h可见萌发形成的单菌落。肉眼观察平皿内菌丝，并使用显微镜观察，若明显由一个子囊孢子萌发形成辐射状菌丝，基本可视为单孢菌株。无菌操作及时切取菌丝生长末端的单根菌丝，转接至新的培养基内，即获得纯化的单孢菌丝。单孢群体（F1）编号为M-n，M表示亲本菌株名称；n为数字编号，代表第n个单孢。

1.3 交配型基因的测定

羊肚菌DNA的提取参照参考文献[8]。菌丝体或组织块经液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%，PVP 2%，Tris-HCl 100 mmol·L-1， EDTA 20 mmol·L-1， NaCl 1.4 mol·L-1）裂解获得DNA粗提液，经V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）=25∶24∶1的混合液去除蛋白后，再经乙醇沉淀、RNAase消解去除RNA污染，最终获得纯净DNA，稀释至50 ng·μL-1，4℃储存备用。

交配型基因的扩增引物为MAT1、MAT2[8]。扩增目标片段大小分别为1 837 bp和1 740 bp，分别为MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全长。扩增体系 （25 μL） 包括 2 × PCR mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的 MAT1或 MAT2引物各 1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。所有扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.4 栽培出菇

羊肚菌人工栽培方法参照参考文献[9]。菌种制备采用三级菌种制作方案，栽培种和外源营养袋配方参照参考文献[10]。通过复筛获得菌丝生长快且产核能力强的单孢菌株，根据交配型基因类型分为2组。从每个组内随机选取一个菌株，即选取不同交配型基因不同的单孢之间随机进行组合配对，并分别在2个组内随机挑选2株混合播种，进行栽培出菇试验。每个处理3个小区，每个小区面积0.5 m2。栽培试验于2020年11月～2021年4月在北京市大兴区青云店镇羊肚菌生产基地进行。播种时间根据当地气候条件而定（11月上旬），播种量为0.5 kg·m-2；播种后 7 d～20 d，进行 1.2 kg·m-2的外源营养袋补充处理；出菇前20天进行撤袋、催菇操作。记录出菇时间、出菇密度、出菇时土壤及环境温度。栽培出菇后的子囊果为F2群体。

1.5 数据统计分析

待子囊果7分～8分成熟后，全部采收，统计出菇个数、鲜菇产量。测定鲜子囊果的菌盖长度和宽度、菌柄的长度和直径。测定每个组合的全部子囊果，取平均值。显著性采用SPSS 16.0软件中Duncan式新复极差法进行分析。最后将子囊果自然晾干，称量获得干质量。折干率（D，%）指采收的食用菌经晾晒（或烘干）后的比重，其计算公式为：

式中：W1为晾干（或烘干）后子囊果质量（g·m-2）；W2为晾干（或烘干）前鲜子囊果质量（g·m-2），即鲜菇产量。

根据陈影等[11]的研究，梯棱羊肚菌的6个子实体数量性状（菌盖的长度和宽度、长度与宽度比值、厚度以及菌柄的长度和直径）基本符合正态分布，可以作为羊肚菌子实体数量性状的评价指标。参照参考文献[12]的赋分法并稍作改进，对菌盖长度、菌柄长度、菌盖直径、菌柄直径赋分评价，总得分高者为性状优良的子囊果。

2 结果与分析

2.1 单孢菌株的交配型基因分型

试验获得的单孢菌株的基因型检测结果见表1。

表1 单孢菌株的交配型基因分型Tab.1 Analysis of mating type genes of monospora strains

由表1可知，分离得到的单孢菌株只含有2种交配型基因中的1种。根据交配型基因的不同分为2组。

2.2 单孢杂交组合的出菇情况

在田间将含有不同交配型基因的单孢菌株两两混合播种，并在分别在2个组内随机挑选2株进行混合播种，共配制组合190对。经田间调查统计，100个不同交配型单孢混合播种组合及90个同交配型混合播种组合全部可以观察到菌丝生长，并产生“菌霜”（分生孢子），有73个组合能形成直径1 mm～2 mm的白色圆球形原基，但最终仅有55个组合发育成成熟的子囊果。在这55个组合中，每个组合在0.5 m2试验小区内的统计结果见表2。

表2 子囊果正常生长发育组合的统计Tab.2 Data statistics of combinations that normally grew and developed

如表2所示，在能发育成熟子囊果的55个组合中，不同交配型混合播种的组合为44个，占4/5；相同交配型混合播种的组合为11个，占1/5。各组合收获得子囊果个数差异较大，从2个（组合6、组合8、组合29） 到19个（组合49），反映了不同组合间出菇的能力不同。各组合0.5 m2区域内鲜子囊果总质量最少为20.00 g（组合20），最多为389.95 g（组合15）；干子囊果总质量最少为5.00 g（组合20），最多为24.75 g（组合48）。单个子囊果鲜质量为6.67 g～46.67 g；单个子囊果干质量为0.72 g～6.19 g。

2.3 单孢混合播种组合子囊果优选情况

实际生产中，羊肚菌的稳产、高产最为重要。因此，对能形成正常子囊果的55个组合的产量进行分析，根据各组合的鲜菇和干菇产量，筛选出鲜菇产量大于300 g·m-2（每667平方米日光温室按有效栽培面积450 m2计算，折合鲜菇产量为135 kg）和干菇产量大于24 g·m-2的杂交组合，共15个。优选组合的产量统计见表3。

表3 筛选出15个组合的产量统计Tab.3 Yield statistics of 15 combinations selected

由表3可知，其中组合15（CY-21×HM-13）鲜菇产量达788.91 g·m-2，折合每667平方米鲜菇产量为355.01 kg；其次组合39（Y15-8×HM-12） 鲜菇产量达620.12 g·m-2，折合每667平方米鲜菇产量为279.05 kg。筛选出的15个组合子囊果折干率为3.94%～12.61%。

筛选出的高产量15个组合的子实体性状统计结果见表4。

表4 筛选出的15个组合的子囊果性状统计Tab.4 Statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表4可知，15个杂交组合中，菌盖平均长度最小为6.42 cm（组合1，CY-1×Y15-1），最大为10.26 cm（组合39，Y15-8×HM-12）；菌柄平均长度最小为4.02 cm（组合1，CY-1×Y15-1），最大为9.6 cm（组合41，Y15-8×HM-14）；菌盖平均直径最小为2.58 cm（组合15，HM-13×CY-2），最大为4.67 cm（组合49，Y15-16×HM-14）；菌柄平均直径最小为0.92 cm（组合1，CY-1×Y15-1），最大为2.58 cm（组合41，Y15-8×HM-14）。通过初步比较，组合41、组合49、组合39在单一性状中表现尤为突出。

商品性优良的羊肚菌子囊果标准为个大、菇型松塔型，反映在菌盖长度、菌柄长度、菌盖直径、菌柄直径值的大小，因此对这些指标进行综合评价，其评价结果见表5。

表5 筛选出的15个组合的子囊果性状赋分统计Tab.5 Score statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表5可知，15个组合中得分由高到低排列依次为组合41（Y15-8×HM-14）、组合49（Y15-16×HM-14）、组合 39（Y15-8×HM-12）、组合16（CY-21×HM-14） 和组合 5（CY-1×HM-14）、组合 40（Y15-8×HM-13）、组合 53（Y15-22×HM-12）、组合 4（CY-1×HM13）、组合 54（Y15-22×HM-13）和组合 48（Y15-16×HM-13）、组合 36（HM24×Y15-1）、组合 10（HM-14×CY10）、组合13（CY21×Y15-24）、组合 15（CY21×HM13）、组合 1（CY-1×Y15-1）。得分越高表明该组合子囊果形状越好，具有优质潜力。因此，选取得分超过20的组合，即组合41（Y15-8×HM14）、组合49（Y15-16×HM14）、组合39（Y15-8×HM12） 作为优选的组合。

2.3 优选组合子囊果组织分离菌株交配型基因检测

优选组合子囊果组织分离菌株交配型基因检测结果电泳图见图1。

由图1所示，对优选的3个子实体进行组织分离，获得3个菌株，经检测均含有MAT1-1-1和MAT1-2-1两种交配型基因，可以作为下一步品种筛选的菌株使用。

图1 优选组合交配型基因PCR检测结果Fig.1 PCR detection results of mating type genes in selected combinations

3 讨论与结论

3.1 羊肚菌单孢田间杂交可以用于品种选育

羊肚菌属于子囊菌，缺少香菇（Lentinus edodes）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus） 等担子菌菌丝形成的锁状联合，难以在实验室内通过菌丝的观察而得出是否杂交成功的结果。因此，羊肚菌交配型基因预测出菇还仅停留在实验室阶段，只能作为必要条件而不是充要条件。将羊肚菌单孢菌株在田间混合播种，有73个组合能形成直径1 mm～2 mm的白色圆球形原基，但最终仅有55个组合发育成成熟的子囊果。因此可以直接通过观察原基形成和子囊果的发育作为品种筛选的直观指标，简单易行，并且方法可靠。但是试验中相同交配型的单孢混合播种也可以形成原基，其中一些也可以正常发育成子囊果，这与梯棱羊肚菌为异宗结合真菌[3-5]，需要MAT1-1-1和MAT1-2-1两种交配型基因才能完成生活史的结论不一致。柴红梅等研究表明单孢分离菌株的异核不对称特揭示梯棱羊肚菌为假同宗结合真菌[13]。因此，梯棱羊肚菌可能存在“单孢菌株出菇”的现象。有研究推测，分生孢子可能扮演“不动精子”的角色，从而发挥作用[14-15]。由于此次试验组合数量多，不同单孢组合间未完全进行区隔，各组合的分生孢子可能随空气流动，从而提供不同的交配型基因。后续研究中，可以进行单孢菌株的完全区隔试验加以验证。

3.2 综合分析评价子囊果形状更为科学

对于羊肚菌农艺性状包括菌丝长势、抗病性、产量表现等进行分析。190个组合中仅有73个形成原基，出菇率为38%，但在子囊果发育过程中有18个组合的子囊果发生败育，最终发育成子囊果的组合比例仅为29%。因此，抗逆性是品种选育的一个重要指标。

在羊肚菌的栽培中，产量是评价菌种特性的极其重要的指标。但是子囊果的性状也尤为重要[11]，也是产品具有商品性的重要参考。农艺优良性状是指具有许多可辨别性状的最佳表现，除产量外，还包括一系列表型，如菌丝生长阶段的萌发势、营养势，子囊果生长阶段包括抗病性、子囊果形状、单菇质量、菌盖长、菌盖直径、菌柄长度、菌柄直径。因此，研究以产量为初筛指标，筛选出产量高于300 g·m-2的组合有15个，对菌盖长度、菌柄长度、菌盖直径、菌柄直径等性状进行综合评价赋分后，筛选出得分前3位的优选组合为组合41（Y15-8×HM-14）、组合 49（Y15-16×HM-14） 和组合 39（Y15-8×HM-12）。

3.3 羊肚菌单孢杂交方法可获得杂交菌株

包括羊肚菌在内的大多数子囊菌真菌，交配型基因有很重要的作用，是有性生殖的关键调控因子，因此交配型位点基因是羊肚菌品种选育中重要的分子标记。现有的生活史表明，仅MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因同时存在，羊肚菌才能完成有性生殖过程，并成功形成可育的子实体（子囊果）[12]。单孢群体F1只含有1种交配型基因，可以采用田间混合播种的方法使2种交配型菌丝结合，从而完成有性生殖。

目前在羊肚菌的栽培中，普遍沿用担子菌的思维模式，通过采用组织分离的方法获得栽培菌株用于生产中，但羊肚菌的菌丝细胞存在多个细胞核[10]，而且随着组织分离和转代的次数增加，羊肚菌细胞核会发生不均等迁移，导致菌株中的其中1种基因型逐渐减少或衰退[6-7]，无法完成有性生殖的过程，从而无法出菇。因此，在品种选育过程中通过组织分离获得优选子囊果的组织分离菌丝体必须经过交配型基因的检测，确保同时含有2种交配型基因，才能用于下一步生产中。

此次试验梯棱羊肚菌F1单孢菌株间混合播种组合出菇率为38%，发育成子囊果的比例为29%。通过子实体性状和产量分析，从F2出菇子囊果筛选出产量较高的15个组合，平均单产为0.30 kg·m-2～0.78 kg·m-2；优选出3个菇型性状的组合组合41（Y15-8×HM-14）、组合 49（Y15-16×HM-14） 和组合39（Y15-8×HM-12）。从所筛选的3个组合子囊果经过组织分离得到3个杂交菌株，交配型检测表明均含有2种交配型基因，该项试验结果为羊肚菌单孢杂交育种工作奠定了基础。