中国致心律失常性右心室心肌病患者常见基因突变检测及临床分析

杨丰菁，仇晓亮，张曼，刘欣，秦旭光，朱天刚，王福军，张莉，胡大一，刘文玲

致心律失常性右心室心肌病（ARVC）是一种与心律失常性心原性猝死风险增加相关的遗传性心肌疾病，其特征是心室心肌渐进性丧失，被纤维或纤维脂肪组织取代[1]。

ARVC 是青少年和运动员心律失常性猝死的主要原因之一，了解其遗传特征和病理过程对ARVC的诊断和治疗具有重要意义。

在近十余年中，已经报道了一些基因的异常导致ARVC。大多数ARVC 由编码桥粒蛋白的基因突变引起，如plakophilin-2（PKP2）[2-10]、desmoplakin（DSP）[11]、desmoglein（DSG2）[12-13]、plakoglobin（JUP）[14-15]和desmocollin -2（DSC2）[16-18]。此外，有报道称一些非桥粒基因与ARVC 相关，如转化生长因子β3（TGFβ3）[19]、跨膜蛋白43（TMEM43）[20-21]、lamin A/C（LMNA）[22]、desmin（DES）[23]、titin（TTN）[24]、phospholamban（PLN）[25]和αT-Catenin（CTNNA3）[26]。

这些针对ARVC 的遗传学研究提高了对该病发病机制的认识。但由于ARVC 的遗传和临床异质性以及缺乏长期的大队列家系共分离研究，基因型与表型相关性研究的结论不尽相同。更多元的地理和种族背景对拓展研究有很大的帮助。近年来，一些研究对中国ARVC 患者的遗传变异进行了分析[9,10,27-28]。本研究对32 例ARVC 患者进行了基因型和临床表型研究，以确定该队列中桥粒和桥粒外的变异谱，并确定潜在的基因型-表型关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究中32 例ARVC 患者来自ARVC 注册研究[10]。研究方案经北京大学人民医院伦理委员会批准。所有患者均获得知情同意书。

临床评估包括家族史和患者病史、体格检查、12 导联心电图、经胸超声心动图。部分患者接受信号平均心电图、24 小时动态心电图和MRI 检查。

1.2 基因变异的分析

根据欧洲心脏病学会、国际工作组标准[29]和2010 工作组更新的诊断标准[30]，研究者对其中32例患者进行了评估。对32 例符合修订的工作组标准的非相关汉族患者进行了PKP2、DSP、DSG2、DSC2、JUP、DES、TGFβ3和TMEM43的筛选。从全血样本中提取基因组DNA。使用PCR 扩增上述基因DNA 片断，应用DNA 直接测序方法对上述基因全部外显子及其相邻内含子进行测序[10,31]。由北京天一辉远生物科技有限公司测序。

所有变异均根据人类基因组变异学会命名指南[32]，基于参考序列进行命名（DSC2：NM_024422.3；DSG2：NM_001943.3；DSP：N M_004415.2；JUP：NM_021991.2；PKP2：NM_004572.3）。所有的变异都经Mutalyzer（http://www.LOVD.nl/mutalyzer）查验，并通过Mutalyzer（http://www.LOVD.nl/mutalyzer）[33]确认命名。然后所有变异均在ARVC 的遗传变异数据库(http://www.arvcdatabase.info/Default.aspx）,dbSNP 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）,1 000 人基因工程数据库（http://www.1000genomes.org）,或外显子组变异服务器（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）检查。各变异也通过在线PROVEAN 软件（http://provean.jcvi.org/index.php），SIFT 软件（http://sift.jcvi.org/）和Polyphen2 分析检查。

1.3 统计学方法

所有分析均使用SPSS 22.0 软件进行。符合正态分布的连续变量表示为均数±标准差，组间比较采用t检验或单因素方差分析。分类变量表示为计数、率或构成比。率的比较用卡方检验。双侧P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 32 例患者基线特征

32 例患者中，最常见的临床表现为心悸，共23 例（71.9%）。16 例（50.0%）表现为晕厥，3 例（9.4%）表现为黑矇。有心脏整体或局部功能异常或结构改变的患者共28 例（87.5%），复极异常患者24 例（75.0%），除极异常患者23 例（71.9%），心律失常患者25 例（78.1%）。7 例（21.9%）患者有家族史。

2.2 32 例患者桥粒和桥粒外的变异谱

在18 例（56.3%）患者中发现了4 个桥粒基因PKP2、DSP、DSG2、DSC2的17 个突变，包括6 个新突变（6/17，35.3%）。桥粒外基因未发现突变。突变总数为23 个，包括不同患者的相同突变。错义突变是最常见的突变类型，占47.8%。其次是移码突变，占26.1%，无义突变、整码突变和拼接突变分别占13.0%、8.7%和4.3%，各变异情况见表1。

表1 32 例患者基因变异汇总

32 例患者中，11 例（34.4%）存在PKP2突变，3例（9.4%）存在DSP突变，3 例（9.4%）存在DSG2突变，4 例（12.5%）存在DSC2突变。5 例（15.6%）患者出现多个突变。基因型-表型分析未发现突变患者与非突变患者、单突变患者与多突变患者在性别、首发症状、年龄、晕厥、V1～V3T 波倒置、Epsilon 波、V1～V3QRS ＞110 ms、24 小时心电图室性早搏＞500次、非持续性室性心动过速、心室颤动、阵发性室上性心动过速 等临床特征及预后因素存在差异。PKP2突变也未显示出任何临床和预后价值，见表2。

表2 32 例ARVC 患者基因突变与临床表现的相关性

3 讨论

ARVC 相关基因目前发现了15 个，包括5 个桥粒蛋白基因（JUP、DSP、PKP2、DSG2、DSC2）和10 个非桥粒蛋白[34]。本研究筛查了较常见的8 个致病基因，确定了32 例ARVC 患者的基因型。目前发现PKP2是最常见的致病基因，本研究结果与之前报道的一致，表明PKP2是最常见的突变基因，占ARVC 患者总数的34.4%。这提示可能与种族、区域无关[35]。PKP2突变的患者与无突变患者间临床表型无差异。据报道，DSP是ARVC 患者中仅次于PKP2的第二个常见突变基因[36]。本队列中，发现了3 个变异，包括一个新发现的Q271L突变，其临床意义尚不清楚。在2 例患者中发现M1NfsX30，在数据库中显示是单核苷酸多态性（SNP）。该队列中有3 个突变位于DSG2基因高度保守的残基中，其中R46G 是新发现的突变。在4 例不相关的患者中发现4 个DSC2突变，其中2 例为G790del突变，2 例为新发现的错义突变V420L。根据SIFT和PROVEAN 预测，V420L 可能是一个致病突变。PKP2基因N852fsX930 突变可能是中国人群的一个热点突变，因为有3 例严重的ARVC 患者携带这一突变，这在中国的另一项研究中也有相同发现[8]。然而，由于临床表现的不同和年龄依赖性外显率，建议谨慎解释基因变异。除了在线的in silicon预测外，ARVC 变异数据库（http://www.arvcdatabase.info/Default.aspx）的协作、双向更新和及时的临床随访数据对于解释特定的变异非常重要。

值得注意的是，研究中未发现非桥粒体基因。Bao 等[8]在100 例ARVC 患者中筛选了9 个ARVC 致病基因，共鉴定出59 个突变，其中93%位于桥粒蛋白基因。非桥粒蛋白基因突变仅有4 个（TMEM432 个，TGFβ32 个），提示中国ARVC 人群中非桥粒蛋白基因突变较少。用第一代测序技术对其进行评价可能产量低，成本高。然而，随着新一代测序平台的发展和突变检测面板的商业化，所有致病基因的筛选变得更加容易。

基因型-表型关系和精准医学是近年来研究的热点和未来医学模式。迄今为止，多项研究表明，基因突变可能在ARVC 的临床表现、严重程度和预后中发挥重要作用。一项北美的研究发现，PKP2突变的先证者比无PKP2突变的ARVC 先证者更早出现症状和心律失常[7]。在一项来自中国人群的研究中，Bao 等[8]报道了突变携带者，尤其是PKP2，有室性心动过速病史的比例更高，且更易诱导快速室性心动过速。也有报道DSP突变携带者发生左心室功能不全（40%）和心力衰竭（13%）的几率是PKP2突变携带者的4 倍以上。

一项系统综述和Meta 分析显示，桥粒蛋白基因突变患者发病年龄更早，V1～V3导联T 波倒置发生率更高，且有家族史[37]。然而，本研究结果显示，携带与未携带桥粒蛋白基因突变的两类患者临床特征无区别。这可能与纳入的病例数较少有关。在本研究中，在5 例患者中发现了多个突变。据报道，多种突变在ARVC 人群中普遍存在，其临床意义备受关注。在Bauce 等[38]的研究中，多个突变携带者显示心电图复极改变和左心室受累的发生率明显更高，但在短期随访中没有更严重的心律失常发生。根据Rigato 等[39]的报告，多个突变携带者心肌浸润性改变更多见且有更严重的表型，并发现复合或双基因杂合突变是终生重大心律失常事件和心原性猝死的较强危险因素。在欧洲的一项队列研究中，4%的患者发现具有多个突变的复杂遗传状态，并且与更多的猝死相关[40]。在本研究中，5 例ARVC 患者中发现多个突变，其中1 例在20 岁游泳时发生心原性猝死。患者存在2 个PKP2复合杂合突变S249T和N852fsX930。无义突变通常预示较差的临床表型。一项中国ARVC 患者的研究中，Zhou 等[9]对48 例中国汉族ARVC 患者的桥粒体基因突变进行了全面分析，表明左心室受累可能是心脏桥粒蛋白基因无义突变携带者的一种迹象。在本研究中，3 例ARVC 患者为无义突变携带者，其中1 例左心室壁功能减退，另外2 例左心室正常。这些差异可能与样本大小、种族、背景和生活方式的差异有关。

人类遗传数据正在以不断增长的速度积累，这有助于了解不同个人和人群对常见疾病的易感性。临床医生、患者、卫生系统、制药行业以及政策制定者对精准医疗的日益认可，反映了一个正在迅速加速并将对医学实践产生重大影响的领域的出现。事实上，专业建议和基因检测在心脏通道疾病和心肌病中的作用开创了精准医疗时代的工作。随着DNA 测序技术的进步和精准医学相关技术的突破，ARVC 这一致命但可控制的遗传病有望出现新的诊断、风险分层和治疗规范。

致谢：衷心感谢Frank Marcus 教授和Guy Fontaine 教授对本研究的支持，衷心感谢范玉新教授对本研究的指导，感谢支持过本研究的各位医师

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突