高压液相色谱法同时测定泌感合剂中6种黄酮类成分研究

2022-07-02 14:38彭敏符映均童晓东姜晓燕杨水英刘忠美倪红辉张硕
世界中医药 2022年10期
关键词:合剂黄芩批号

彭敏 符映均 童晓东 姜晓燕 杨水英 刘忠美 倪红辉 张硕

摘要 目的:建立高压液相色谱法(HPLC)同时分析并测定泌感合剂中落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的含量。方法:采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)-0.4%磷酸水(B),梯度洗脱;检测波长320 nm;流速1.0 mL/min;柱温23 ℃。结果:落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素分别在0.144~1.44 μg(r=0.999 9)、0.196~1.96 μg(r=0.999 7)、0.076~0.76 μg(r=0.999 3)、0.034~0.34 μg(r=0.999 3)、0.032~0.32 μg(r=0.999 8)、0.026~0.26 μg(r=0.999 5)范围内进样量与峰面积线性关系良好;平均回收率在分别为95.6%、96.3%、94.5%、92.3%、97.8%、95.2%;相对标准偏差(RSD)分别为1.7%、1.5%、2.2%、1.2%、2.0%、1.6%。结论:该方法操作简单、稳定、可重复,可用于同时分析测定泌感合剂中6种黄酮类成分的含量。

关键词 泌感合剂;落新妇苷;野黄芩苷;野黄芩素;木犀草素;芹菜素;异鼠李素;高压液相色谱法;含量测定

Simultaneous Determination of Six Flavonoids in Migan Mixture by HPLC

PENG Min,FU Yingjun,TONG Xiaodong,JIANG Xiaoyan,YANG Shuiying,LIU Zhongmei,NI Honghui,ZHANG Shuo

(Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nantong 226000,China)

Abstract Objective:To develop a method for simultaneous determination of astilbin,scutellarin,scutellarein,luteolin,apigenin,and isorhamnetin in Migan Mixture by high-performance liquid chromatography(HPLC).Methods:Separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) at 23 ℃.The mobile phases were methanol(A)-0.4% phosphoric acid(B) with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength was 320 nm.Results:Astilbin,scutellarin,scutellarein,luteolin,apigenin,and isorhamnetin showed good linearity between the injection volume and the peak area at 0.144~1.44 μg(r=0.999 9),0.196~1.96 μg(r=0.999 7),0.076~0.76 μg(r=0.999 3),0.034~0.34 μg(r=0.999 3),0.032~0.32 μg(r=0.999 8),and 0.026~0.26 μg(r=0.999 5),respectively.The average recoveries were 95.6%,96.3%,94.5%,92.3%,97.8%,and 95.2%,with RSDs of 1.7%,1.5%,2.2%,1.2%,2.0%,and 1.6%,respectively.Conclusion:This method is simple,stable,and repeatable,which can be used to determine the content of six flavonoids in Migan Mixture by HPLC.

Keywords Migan Mixture; Astilbin; Scutellarin; Scutellarein; Luteolin; Apigenin; Isorhamnetin; High-performance liquid chromatography; Simultaneous determination

中圖分类号:R285.5文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.004

泌感合剂是由白花蛇舌草、金钱草、半枝莲、地榆、土茯苓、炒知母等八味药材制备而成的中药合剂,属于南通市中医院自制制剂。用于治疗湿热引起的淋症、带下,对肾盂肾炎、尿道炎引起的尿急、尿频、尿痛,宫颈炎引起的阴道刺痒、带下有较好的治疗作用[1]。

研究发现,黄酮类物质是泌感合剂的主要药效物质[2],其中野黄芩苷[3]、落新妇苷[4]、木犀草素[5-6]、野黄芩素[7]等均具有抗炎、抗氧化作用。2015版《中华人民共和国药典》中,野黄芩苷、落新妇苷分别是半枝莲、土茯苓的指标性成分[8];研究表明,野黄芩素、木樨草素、芹菜素、异鼠李素也是半枝莲黄酮成分的特征组成[9-10]。

本课题前期测定了总黄酮及其代表物质山柰素、槲皮素的含量[2,11],但这并不足以反应制剂的质量,现结合黄酮类有效组分研究与《中华人民共和国药典》含量测定方法,同时测定落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的含量,以期从多成分、协同作用的角度,更好地控制产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(配DAD检测器,赛默飞世尔科技有限公司,美国,型号:DIONEX-UltiMate 3000);分析天平(梅特勒-托利多有限公司,瑞士,型號:MS105D)。

1.2 试剂 对照品落新妇苷(批号:111798-201504)、野黄芩苷(批号110842-201709)、木犀草素(批号:111520-201605)、芹菜素(批号:111901-201603),购自中国食品药品检定研究院;异鼠李素(批号:YZ093020)、野黄芩素(批号:YZ094015),购自南京源植生物科技有限公司。水为超纯水;甲醇为色谱纯;乙酸乙酯、磷酸等均为分析纯。

1.3 分析样品 泌感合剂为本院制剂(批号:20171023、20180413、20180821);药材金钱草(批号:170830)、白花蛇舌草(批号:180602)、半枝莲(批号:180731)、川牛膝(批号:170518)、土茯苓(批号:180912)、地榆(批号:180304)、炒知母(批号:181114)、炒黄柏(批号:180613),均购自南通三越中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸水(B),洗脱梯度(0~25 min,29%A;26~35 min,36%A;36~42 min,38%A;43~66 min,48%A;67~78 min,53%A)流速为1 mL/min,进样量10 μL;柱温:23 ℃,检测波长320 nm。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素标准品0.72 mg、0.98 mg、0.38 mg、0.17 mg、0.16 mg、0.13 mg,置于容量瓶中,加70%甲醇定容至20 mL。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取泌感合剂20 mL,加入浓盐酸0.3 mL,100 ℃水浴回流1 h,静置至室温,用乙酸乙酯萃取3次,每次50 mL[2]。取乙酸乙酯层,合并萃取液,倒入蒸发皿中水浴蒸干,冷却后用70%甲醇溶液定容至20 mL容量瓶中。

2.4 阴性对照溶液的制备 按泌感合剂处方工艺,照“2.3”项下的方法分别制备缺土茯苓、缺半枝莲的阴性对照溶液。

2.5 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液,按照“2.1”项下的色谱条件分别进样测定。结果各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,理论塔板数以各色谱峰均大于3 000,阴性无干扰,表明该方法专属性良好。见图1。

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液4 μL、8 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL,按照“2.1”项下的色谱条件,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并计算线性方程。见表1。

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μL,按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次,记录峰面积并分别计算相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)。结果落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的RSD分别为0.17%、0.16%、1.4%、0.56%、0.53%、0.29%,表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 精密量取泌感合剂(批号:20180821)20 mL,按照“2.3”项下的方法,制备成供试品溶液,按照“2.1”项下的色谱条件,于0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h分别进样,并记录峰面积值。计算得落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.76%、0.62%、1.55%、1.24%、1.84%、1.27%,表明泌感合剂在室温下24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 精密量取泌感合剂(批号:20180821)6份,每份20 mL,按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液,以“2.1”项下的色谱条件进样测定,记录峰面积并计算RSD值。结果落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素含量的RSD分别为1.63%、1.22%、1.68%、1.49%、0.88%、1.54%,表明该方法重复性良好。

2.10 回收率试验 精密量取6份已知含量的泌感合剂(批号:20180821,落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素含量依次为0.040 8、0.116 4、0.040 2、0.005 6、0.014 9、0.010 2 mg/mL),每份10 mL,加入适量对照品,按照“2.3”项下的方法制备成加样供试品溶液,并以“2.1”项下的色谱条件进样测定,记录峰面积,并分别计算含量及加样回收率。见表2。

2.11 样品测定结果 取泌感合剂三批(批号:20171023、20180413、20180821),每批2份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,并以“2.1”项下的色谱条件进样测定,每批样品平行测3次。计算每批样品中落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的平均含量。见表3。

3 讨论

泌感合剂具有良好的清热解毒功效,这种功效可能主要来源于其中半枝莲、土茯苓、白花蛇舌草、金钱草等所含的黄酮类成分[12-15]。本研究在原有制剂标准的基础上对这类成分进一步分析,除了槲皮素与山柰素外[2],泌感合剂还含有绿原酸、咖啡酸、花旗松素、芹菜素、落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、异鼠李素等组分。尽管其中绿原酸、咖啡酸、花旗松素具有显著的抗炎、抗菌、抗氧化作用[16-18],但是在既定色谱条件下,绿原酸、咖啡酸专属性较差,花旗松素分离度较差,均无法用于含量测定。

本实验研究的6种黄酮类成分吸收波长差异较大,落新妇苷在292 nm有最大吸收[19],野黄芩苷、野黄芩素、芹菜素在330 nm有最大吸收[20],木犀草素、异鼠李素在360 nm有最大吸收[21]。考虑落新妇苷的分离度、各个目标成分的峰型对称性、阴性干扰及基线的平稳程度,分别比较了泌感合剂梯度洗脱过程中不同时段在290 nm、300 nm、320 nm、360 nm的色谱行为,最终选择320 nm为整个梯度洗脱过程的检测波长。尽管单一波长检测能够兼顾6种成分,但是多波长检测可能灵敏度、专属性更高。

在高效液相色谱中,柱温是影响柱效及分离度的重要因素,偏高的柱温能在一定程度上提高柱效,缩短分离时间,但会导致结构相似的成分之间的分离度降低。本实验先后比较过25 ℃、30 ℃、35 ℃条件下的色谱行为,发现芹菜素与异鼠李素的分离度均较差,柱温降到23 ℃后,峰型显著改善。

综上所述,本研究发现了泌感合剂其中可用于含量测定的6种黄酮类成分,方法稳定、可靠,从多成分、多靶点的角度对泌感合剂的质量标准做出补充,有利于更好地控制产品质量。

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(2020-02-04收稿 本文编辑:吴珊)

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