基于网络药理学探索丹参治疗膜性肾小球肾炎的作用机制

朱永秋 张法荣

摘要 目的：采用网络数据挖掘方法研究丹参对膜性肾小球肾炎（MGN）的作用机制。方法：运用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）及与疾病相关的人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、DrugBank、DisGeNET数据库分别检索筛选，获得丹参的有效活性成分、药物作用靶点及MGN的相关靶点，运用Cytoscape 3.7.2构建丹参-成分-靶点网络，并根据自由度筛选出核心成分。采用STRING软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并在Cytoscape 3.7.2平台进行拓扑分析并筛选出关键靶点。使用基因注释工具Metascape對靶点基因进行注释和分析，得到靶点的生物过程和通路富集结果。结果：共获得65个丹参有效活性成分，99个目标靶点，与MGN相关的靶点15个，关键靶点8个。得到肾上腺素受体、MAPK级联的正调控、细胞阳离子稳态、激素水平的调节、跨膜转运的调控等9条生物过程和通路富集分析。结论：传统中草药丹参活性成分对MGN的作用机制体现了丹参多成分、多靶点、多途径作用的特点，为丹参治疗MGN的作用机制阐明提供了依据，并为中药的作用机制研究提供参考思路。

关键词 网络药理学;丹参;活性成分;活血化瘀;膜性肾小球肾炎;多靶点;肾上腺素能受体;机制

Mechanism of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma in Treatment of Membranous Glomerulonephritis Based on Network Pharmacology

ZHU Yongqiu1，ZHANG Farong2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（SMR） in the treatment of membranous glomerulonephritis（MGN） by network pharmacology and data mining.Methods：The active components and targets of SMR and MGN targets were searched from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），DrugBank，and DisGeNET.Cytoscape 3.7.2 was used to construct an SMR-component-target network，and the core components were screened out according to the degree of freedom.The protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING，and the key targets were selected through topological analysis on the platform of Cytoscape 3.7.2.The target genes were annotated and analyzed by Metascape，and the biological processes and pathway enrichment results were obtained.Results：Sixty-five active components of SMR，99 targets，15 MGN-related targets，and eight key targets were obtained.Nine biological processes and pathways，including adrenoceptors，positive regulation of MAPK cascade，cellular cation homeostasis，regulation of hormone levels，and regulation of transmembrane transport，were analyzed.Conclusion：The mechanism of SMR active components on MGN embodies the multi-component，multi-target，and multi-pathway characteristics of SMR，which provides the basis for clarifying the mechanism of SMR in the treatment of MGN and ideas for the research on the mechanism of Chinese medicine.

Keywords Network pharmacology; Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; Active components; Activating blood and resolving stasis; membranous glomerulonephritis（MGN）; Multiple targets; Adrenoceptor; Mechanism7DFACC5F-9F9A-4D1E-A506-DD6549A3DA4A

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.001

膜性肾小球肾炎（Membranous Glomerulonephritis，MGN）又称膜性肾病，是以病理表现为肾小球基底膜上皮下免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为特征的一种临床常见肾小球疾病[1-2]。好发于中老年人，且男性多见，临床起病隐匿，自然病程差异较大，约80%患者临床主要表现为肾病综合征的“三高一低”或无症状蛋白尿，常见血栓栓塞、感染等并发症[3-4]。在所有年龄段的肾病综合征人群中，成人膜性肾病血栓栓塞的风险高达37.0%[5]。膜性肾病高凝状态作为血栓前状态，影响肾小球微循环，易导致微血栓形成，甚至发生血栓栓塞并发症，同时肾小球微血管循环障碍，血氧供给不足而促使肾小球硬化，最终致使原发病的恶化。2020年改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）肾小球疾病实践指南提出，对膜性肾病患者的预防性抗凝治疗应基于对血栓事件和出血性并发症风险的评估，虽然选用阿司匹林、华法林、肝素等进行预防性抗凝可以减缓高凝状态，但西药抗凝带来的过敏反应、出血风险、肝肾功能损害等不良反应不可忽视，所以寻求更加安全的方法以缓解高凝状态，预防血栓形成[6]。近年来中医药在改善膜性肾病高凝状态方面的研究显示，应用活血化瘀类中药可缓解高凝状态，预防血栓形成方面优势明显，还可以降低不良反应，提升整体疗效[7]。

丹参作为中药，是历代医家常用的活血化瘀之品，其味苦，性微寒无毒，有活血祛瘀、凉血消痈、通经止痛、清心除烦的功效[8]。近年来，对丹参的研究发现，丹参对心血管系统的作用非常显著，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗纤维化等作用，对肾脏病的治疗具有多效性[9]。其提取物能明显改善肾小球和肾小管萎缩、局灶性钙沉积、间质纤维化、间质炎症和肾组织的症状[10]。

对膜性肾病患者进行预防性抗凝已经成为治疗的重要环节。所以丹参及其制剂常被用来改善膜性肾病患者的高凝状态，也是众多医家临床治疗膜性肾病组方中常用药物[11-13]。如邓跃毅教授认为膜性肾病的发病与肾络瘀阻密切相关，在辨证论治时主张活血、通络法合用，加入活血化瘀通络类中药，以增效减毒排瘀，最终标本兼治起到有效保护患者肾功能的作用[14]。余承惠教授将膜性肾病高凝状态中医辨证论治归为“痰瘀互结”，用药时多选用当归、赤芍、丹参、川芎、桃仁、红花等活血化瘀通络之品，以通络散结，活血化瘀[15]。程锦国教授认为湿热、瘀血是膜性肾病迁延不愈之关键所在，活血化瘀应贯彻治疗的始终[16]。

由于中药丹参所含有效活性成分比较复杂，其对MGN作用机制的研究尚不全面、不明确，若仅通过动物实验和细胞实验研究，对其作用机制进行全面了解存在一定困难。网络药理学通过运用网络数据库、构建“药物-靶标-疾病”相互作用网络，从多成分、多靶点角度出发，实现中药活性成分作用机制的综合分析，可揭示传统中药协同作用于人体的效应机制，被广泛应用于中药活性成分及其靶点治疗疾病作用机制领域的研究[17-18]。为研究中药治疗疾病的效应机制提供了便利条件，为中药治疗不同疾病的应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 丹参活性成分及其对应靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），在首页选择“Herb Name”词条框，输入“丹参”获取丹参条目，获取的丹参分子信息包括分子名称等。筛选口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18的丹参活性成分，全部复制到Excel表格，在成分找靶点的转换器中获取成分的靶点信息，从获取的信息中得到该成分作用的靶蛋白名，将靶蛋白名在UniProt数据库中检索得到对应的靶基因名和UniProt ID。检索结果以Excel格式导出，以UniProt ID为基准删去无效值和重复值，最终得到丹参的靶基因信息。

1.2 MGN相应靶点获取 通过人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）及DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/）数据库，以“Membranous Glomerulonephritis”为关键词检索MGN的相关基因，将从OMIM、DrugBank、DisGeNET数据库中获取的信息合并数据并运用Excel以UniProt ID为准则剔除重合基因条目信息，获得与MGN相关的靶点信息。将筛选出的MGN相关的靶点与丹参活性成分对应的靶点以UniProt ID为查询条件，通过Excel筛选功能映射出丹参与MGN相关靶点重合（交集）部分，获得丹参活性成分作用靶点和MGN作用靶点交集的映射文件，包括获取靶蛋白名、基因名和UniProt ID。

1.3 丹参-成分-靶点-MGN网络构建 将丹参活性成分、成分作用靶点以及与疾病相关的映射靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中，分布构建丹参-成分-靶点网络图、成分-靶点-疾病网络图。在网络中，节点（Node）表示活性成分与蛋白靶点，边（Edge）表示节点之间的作用关系。经过拓扑分析计算出拓扑结构特征值“Degree”，选择网络中大于“Degree”值的节点筛选核心网络，得到丹参活性成分中对MGN作用的主要活性成分。

1.4 丹参成分靶点与MGN靶点交集构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络 将药物-疾病交集靶点基因通过相互作用数据库平台STRING进行相互作用蛋白查询以及PPI网络的构建，“Specie”设置为“人”，最低相互作用評分设置为中等置信度，其他参数设置默认，获得丹参治疗MGN的体内反应网络。使用Cytoscape 3.7.2平台对蛋白网络结构进行网络可视化处理，对PPI网络进行拓扑分析，筛选出PPI网络中的关键靶点。7DFACC5F-9F9A-4D1E-A506-DD6549A3DA4A

1.5 丹参对MGN作用的生物过程和通路富集分析  基因注释与分析资源数据库Metascape整合了基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、UniProt和DrugBank等多个权威的数据资源，对于每个给定的基因列表，使用KEGG通路、GO生物过程、反应基因集等本体源进行通路和过程富集分析，基因组中的所有基因都被用作富集背景[19]。利用Metascape对丹参治疗MGN的靶基因进行GO生物过程和KEGG通路富集分析，得到丹参活性成分治疗MGN靶点的主要生物学功能，将结果进行图表可视化。生物过程和通路是了解药物成分的作用靶点在疾病的发生、发展过程中，通过其功能蛋白的作用参与调控相关的生物过程和通路，执行特定的生物功能[20-21]。

2 结果

2.1 丹参活性成分及其作用靶点的筛选结果 共搜索到202个丹参的成分信息，得到丹参的有效活性成分65种，得到1 349个靶蛋白信息，最终得到丹参活性成分的对应靶点基因99个。见表1。

2.2 MGN靶点预测结果 从数据库OMIM、DrugBank、DisGeNET中分别获取158条、18条、577条关于MGN靶基因信息和UniProt ID，最终检索出744个与MGN相关的靶点信息。将744个MGN靶点与丹参的99个靶点通过Excel筛选取交集，获得15个与MGN相关的映射靶点（即药物-疾病交集靶点），分别为CYP3A4、ADRA1B、ADRA1A、CALCR、ADRA1D、ACHE、ADRA2C、ADRA2B、AKR1B1、BCL2、AR、ADRA2A、ADRB2、APP、CA2。

2.3 丹参-成分-靶点-疾病网络构建及分析 丹参-成分-靶点网络由165个节点（65个丹参成分节点、99个靶基因节点、1个丹参节点）和164条边组成，网络中平均自由度1.988，最小自由度值1，最大自由度值65。图中圆形节点代表丹参，六边形节点代表成分，菱节点代表靶点，节点之间的边代表成分与靶点之间的互相作用关系。见图1。得到核心成分14个，以自由度大小依次为：1，2，5，6-tetrahydrotanshinone（44）、Luteolin（24）、Salviolone（12）、Tanshinone Ⅱa（9）、Poriferasterol（4）、4-methylenemiltirone（3）、Danshenol A（3）、Digallate（2）、Sugiol（2）、Baicalin（2）、Danshenspiroketallactone（2）、Miltionone Ⅰ（2）、Miltirone（2）、Salvianolic acid j（2）。

成分-靶点-疾病网络有22个节点（成分6个、靶点15个、疾病1个），30条相互作用的边，图中八边形节点代表成分，V形节点表靶点，菱形节点代表MGN，节点之间的边代表成分与靶点之间的互相作用关系。见图2。其中与MGN相关且Degree值较高的成分有1，2，5，6-四氢丹参酮（1，2，5，6-tetrahydrotanshinone）、丹参酮ⅡA（Tanshinone Ⅱa）、4-甲亚基丹参新酮（4-methylenemiltirone）、鼠尾草酚酮（Salviolone）、木犀草素（Luteolin）等，这些成分可能是丹参治疗MGN的关键化合物。

2.4 PPI网络的构建及分析 PPI网络中有13个相互作用节点（2个靶蛋白未参与相互作用），26条相互作用连线。见图3。PPI中节点平均自由度为3.47，PPI网络中关键靶点8个，分别为ACHE、APP、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C，这些预测靶点可能是丹参成分治疗MGN的關键靶点。见表2。

2.5 富集分析 对预测的丹参成分-靶点-疾病进行体内生物过程和通路富集分析得到P<0.01、最小计数为3、富集因子>1.5具有代表性的9个分类。见图4。

3 讨论

丹参作为众多医家治疗膜性肾病组方中常用活血化瘀类药物，其主要的活性成分作用均已有药理研究证实[22]，其药理活性广泛且复杂，仍有部分活性物质对某种疾病的作用机制尚未被充分研究。本研究通过网络药理学数据挖掘方法，借助相关数据库和软件对丹参治疗膜性肾病作用机制进行讨论。研究显示丹参参与治疗MGN的主要靶基因有15个，结合“药物-疾病靶点”网络和PPI网络发现丹参治疗MGN的主要活性成分是1，2，5，6-四氢丹参酮、丹参酮ⅡA、4-甲亚基丹参新酮、鼠尾草酚酮、木犀草素等成分。丹参酮ⅡA等丹参酮类化合物可以降低MGN患者血液黏滞性，通过调整血脂和抗血小板活化，保护肾血管内皮细胞，缓解血液高凝状态，阻止微血栓形成;清除阻止过多氧自由基，减少炎症细胞浸润，降低肾组织中免疫分子激活，改善肾小球基底膜通透性，减少尿蛋白丢失，延缓肾间质纤维化的发生[23]。木犀草素是一种黄酮类化合物，具有抗凝血、抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药理作用，起到抗炎抗凝、延缓疾病进展，保护肾脏作用[24-25]。

丹参主要活性成分治疗MGN的作用主要是通过乙酰胆碱酯酶（AChE）、淀粉样βA4蛋白（APP）、α-1B肾上腺素能受体（ADRA1B）、α-1A肾上腺素能受体（ADRA1A）、α-1D肾上腺素能受体（ADRA1D）、α-2A肾上腺素能受体（ADRA2A）、α-2C肾上腺素能受体（ADRA2C）、α-2B肾上腺素能受体（ADRA2B）等靶点在肾上腺素受体、MAPK级联的正调控、细胞阳离子稳态、激素水平的调节、跨膜转运的调控等9条基因集、生物过程或通路上富集并参与调控实现的。其中α-1A、-1B和-1D肾上腺素能受体是α-1肾上腺素能受体的3个亚型，它们激活有丝分裂反应，通过促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）级联的正调控参与许多细胞的生长、增殖、分化、应激反应以及炎症反应等过程，进而调控原发性和继发性肾小球疾病的发生发展[26]。特别是核ADRA1A-ADRA1B杂寡聚体调节心肌细胞中苯肾上腺素刺激的胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK）信号，作为MAPK家族的经典信号通路途径，激活的ERK可进入细胞核磷酸化多种转录因子，调控转录基因的表达，最终达到介导细胞生理病理过程的目的，包括细胞生长、增殖、分化、凋亡、转移等[27]。α-2A、-2B和-2C肾上腺素能受体是α-2肾上腺素能受体高度同源的亚型，可抑制腺苷酸环化酶，可通过ERK1/2途径参与调控疾病过程，达到慢性肾功能衰竭的保护作用。现代药理研究发现丹参酮类化合物可以通过ERK-2信号通路抑制血小板活化，调整血脂，降低血液黏滞性，改善血液微循环，通过保护肾血管内皮细胞，缓解血液高凝状态，防止微血栓形成[28-29]。据此丹参的活性成分发挥治疗MGN及其并发症的作用或是通过上述生物过程或通路实现的。7DFACC5F-9F9A-4D1E-A506-DD6549A3DA4A

综上所述，基于网络药理学方法探索丹参治疗MGN的作用机制，发现丹参是通过“多成分、多靶点、多通路”来发挥其活血化瘀功效，丹参酮等成分改善膜性肾病高凝状态以延缓肾脏疾病进展的治疗作用，为丹参治疗MGN的临床应用提供依据，也为丹参及传统中药在临床上“异病同治”的应用提供了思路。

参考文献

[1]王海燕.肾脏病学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2008：1032-1040.

[2]Feehally J，Mclntyre C，Cameron JS.Landmark Papers in Nephrology[M].Oxford：Oxford University Press，2013：273-275.

[3]Couser WG.Primary Membranous Nephropathy[J].Clin J Am Soc Nephrol，2017，12（6）：983-997.

[4]刘建芳，齐凯敏，刘光珍.膜性肾病诊断与治疗新进展[J].中国医学创新，2019，16（2）：164-167.

[5]Kerlin BA，Ayoob R，Smoyer WE.Epidemiology and pathophysiology of nephrotic syndrome-associated thromboembolic disease[J].Clin J AM Soc Nephrol，2012，7（3）：513-520.

[6]刘蕾.特发性膜性肾病患者凝血功能障碍与血小板功能亢进[D].南京：南京大学，2017.

[7]郭晓媛，王暴魁.特发性膜性肾病的中医药实验研究进展[J].中华中医药杂志，2018，33（1）：226-229.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2015：77.

[9]万新焕，王瑜亮，周长征，等.丹参化学成分及其药理作用研究进展[J].中草药，2020，51（3）：788-798.

[10]Cai HD，Su SL，Li YH，et al.Protective effects of Salvia miltiorrhiza on adenine-induced chronic renal failure by regulating the metabolic profiling and modulating the NADPH oxidase/ROS/ERK and TGF-p/Smad signaling pathways[J].J Ethnopharmacol，2018，2（12）：153-165.

[11]胡杰，杨洁，孙脊峰.膜性肾病凝血紊乱机制及治疗进展[J].解放军医学杂志，2019，44（3）：266-270.

[12]赵思宇，王琳.单味活血化瘀类中药改善特发性膜性肾病高凝状态研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（5）：79-82.

[13]马赟，仝新强，刘璇，等.中医药治疗特发性膜性肾病概况[J].河北中医，2019，41（7）：1111-1115.

[14]向玲，邓跃毅，刘旺意，等.邓跃毅教授活血化瘀法治疗膜性肾病经验荟萃[J].中国中西医结合肾病杂志，2019，20（3）：189-191.

[15]李华伟.余承惠辨证结合辨病分期治疗特发性膜性肾病经验[J].贵阳中医学院学报，2017，39（5）：12-15.

[16]武亚丹，程锦国.程锦国运用中满分消丸治疗膜性肾病经验介绍[J].新中医，2018，50（1）：188-190.

[17]刘艾林，杜冠华.网络药理学：药物发现的新思想[J].药学学报，2010，45（12）：1472-1477.

[18]Hopkins AL.Network pharmacology[J].Nat biotechol，2007，25（10）：1110-1111.

[19]Zhou Y，Zhou B，Pache L，et al.Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets[J].Nat Commun，2019，10（1）：1523.

[20]Maere S，Heymans K，Kuiper M.BiNGO：a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks[J].Bioinformatics，2005，21（16）：3448-3449.

[21]Jupe S，Akkerman JW，Soranzo N，et al.Reactome-a curated knowledge base of biological pathways：megakaryocytes and platelets[J].J Thromb Haemost，2012，10（11）：2399-2402.

[22]吴成态.基于数据挖掘的中医药治疗特发性膜性肾病用药规律研究[D].武汉：湖北中医药大学，2020.

[23]孙健，腊岩.丹参及其组分的藥理作用以及在肾脏病的最新应用进展[J].中国中西医结合肾病杂志，2010，11（1）：89-91.

[24]刘昕，林琳，倪雅娟，等.木犀草素可减轻异丙肾上腺素诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体的损伤[J].中华老年多器官疾病杂志，2019，18（9）：693-698.

[25]徐秋红，杨洁，李庆，等.密蒙花中木犀草素及其糖苷的药理研究进展[J].中国野生植物资源，2019，38（4）：53-57，62.

[26]程闰夏，杨琳琳，林云，等.p38MAPK信号通路与肾小球疾病关系的研究进展[J].山东医药，2018，58（14）：98-101.

[27]韩懿存，陈玉龙，范修琦，等.白术多糖通过靶向miR-34a抑制食管癌细胞免疫检查点PD-L1表达的机制研究[J].中国中药杂志，2022，47（6）：1658-1665.

[28]Maione F，De Feo V，Caiazzo E，et al.Tanshinone ⅡA，a major component of Salvia milthorriza Bunge，inhibits platelet activation via Erk-2 signaling pathway[J].J Ethnopharmacol，2014，155（2）：1236-1242.

[29]王紫雯，荆鲁，李梓荣，等.丹参川芎嗪注射液联合血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物治疗糖尿病肾病的系统评价[J].中国医药，2021，16（10）：1552-1557.

（2020-06-15收稿 本文编辑：魏庆双）7DFACC5F-9F9A-4D1E-A506-DD6549A3DA4A