千峡湖三种肉食性鱼类肠道微生物群落结构分析

肖善势，张爱菊，刘金殿，王俊，罗伟，郝雅宾，周志明

（浙江省淡水水产研究所，中国水产科学研究院东海水产研究所浙江研究中心，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001）

鱼类肠道存在大量和种类繁多微生物，它们之间以及其与宿主之间相互依存、制约形成一个动态平衡的系统。鱼类肠道微生物在肠道发育、营养消化、免疫防御和拮抗等起到重要作用[1-3]，与鱼类健康息息相关，其群落结构的变化可间接影响宿主健康[4,5]。研究表明：水生生物自孵化后，其肠道菌群随着生长发育会出现一定的定植和演替过程，微生物群落结构差异明显[6,7]，即鱼类肠道微生物组成并不是一成不变，受多种因素影响，是诸多因子共同作用的结果，如鱼类饵料组成、季节、水环境、物种、基因型、发育阶段、养殖模式及投喂策略等[1,8-10]。探究不同因子对肠道微生物群落结构的影响，调节诸多因子以利于宿主健康生长十分必要，对水产养殖业的发展具有重要意义。然而传统分离培养法以及基础分子生物学方法如变性梯度凝胶电泳（DGGE）[11]和末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）[12]等，无法全面准确展示肠道菌群结构，而基于16S rRNA基因的新一代高通量测序研究方法具有灵敏度高和测序量大的特点，可检测到低丰度微生物，极大地推动了肠道微生物的研究。如董学兴等[13]采用高通量测序技术发现，养殖模式通过影响养殖水体中氮磷营养盐的含量来间接影响罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）肠道菌群结构；李健柱等[14]采用高通量测序技术发现鱼菜共生模式下草鱼（Ctenopharynogodon idellus）、鲫（Carassius auratus）、鲢（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichthys nobilis）肠道内含物微生物优势菌群的组成十分相似。目前已比较了不同食性鱼类、草食性鱼类之间、滤食性鱼类之间的肠道微生物[8,14,15]，而对分类地位相近、生活环境相同的肉食性鱼类肠道微生物群落结构的研究却鲜见。

本研究以鲌属的翘嘴鲌（Culter alburnus）和达氏鲌（Culter dabryi）以及原鲌属的红鳍原鲌（Cultrichthys erythropterus）为研究对象，利用高通量测序技术获得其肠道微生物群落结构，以期揭示肉食性鱼类肠道微生物之间的异同，并进一步探究鱼类食性和物种对肠道微生物群落结构的影响以及翘嘴鲌等肉食性鱼类的健康养殖提供一定的数据支撑。

1 材料和方法

1.1 样品采集及DNA 的获取

2019 年8 月在丽水市千峡湖用刺网捕捞翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌，分别命名为LB_CA 组、LB_CD 组和LB_CE 组。挑选活力较好、无外伤，大小相近的三种鱼各4 尾，其中翘嘴鲌平均体质量57.6 g，达氏鲌平均体质量53.4 g，红鳍原鲌平均体质量63.5 g。用75%的酒精消毒鱼体后，解剖并取其肠道内容物于灭菌5 mL 离心管中，置于-80℃保存。用E.Z.N.A.Stool DNA Kit（D4015,Omega,Inc.,USA）试剂盒提取肠道微生物总DNA。

1.2 PCR 扩增和测序

以提取的三种鱼类的肠道微生物DNA 为模板，基于16S rRNA 基因V3～V4 可变区特异性引物（341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，805R：5′-GACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）扩增序列。PCR 体 系25 μL：Phusion Hot start flex 2X Master 12.5 μL，引物341F 及805R 各2.5 μL，DNA 模板50 ng，ddH2O 补至25 μL。PCR 条件：98℃预变性30 s，98℃变性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 个循环，72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，并割胶回收。经AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）纯化后的扩增产物用Qubit（Invitrogen，USA）进行定量。文库的大小和数量分别在Agilent2100 生物分析仪（Agilent，美 国）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上进行评估，在Illumina NovaSeq 平台上进行高通量测序。

1.3 数据分析

根据样品序列条码，将配对端序列分配到每个样品，去除建库引入的条形码和引物序列。在FLASH软件下基于overlap 将双端数据进行拼接。用fqtrim（v0.94）对原始数据进行质量过滤，以获得高质量的clean 标签，并使用Vsearch 软件对嵌合序列进行过滤（v2.3.4）。最后利用DADA2 进行解调，得到特征表和特征序列。多样性指数通过归一化到相同的随机序列来计算。用QIIME2 计算Alpha 多样性（Chao1、observed species、goods coverage、Shannon 和Simpson）并分析样本物种多样性的复杂性。采用Blast 进行序列比对，每个代表性序列用SILVA 数据库对特征序列进行注释。用SPSS20.0 对样本数据进行单因素方差分析，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 样品测序质量分析

对三种鱼类的肠道微生物16S rRNA 基因测序数据进行双端拼接、质控以及嵌合体过滤后，共获得有效序列943 949 条，单个样品平均含有效序列78 662 条，序列长度在400～500 bp 之间（99.96%）。采用DADA2 算法修正扩增子的测序错误，经过去除背景噪音获得特征序列feature 1 094 个，其中翘嘴鲌（LB_CA）共计获得feature 407 个，4 个样品feature 数量分别为191、203、88 和157；达氏鲌和（LB_CD）feature 数量共计666 个，4 个样品分别为259、155、403 和71 个；红鳍原鲌（LB_CE）4 个样品feature 数量分别为166、161、37 和162 个，合计392个。试验基于Chao1 指数建立稀释曲线（图1），随着测序量的不断增加，各样本曲线趋于平缓，表明数据量的增加只会产生少量新的物种，即测序量可涵盖样本绝大多数细菌群落的信息。另外三种鱼类的测序的覆盖度（goods coverage）均在0.995 以上，也表明测序基本涵盖了样品中的全部细菌种类。

图1 三种鱼类样品稀释曲线Fig.1 The rarefaction curve of high-through sequencing results in the three fish species

2.2 肠道微生物多样性分析

feature 特征序列韦恩图显示（图2），三种鱼类的共有feature 为73 个，占feature 总数的6.67%。翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌独有feature 特征序列数分别为207 个、441 个和148 个。翘嘴鲌与达氏鲌共有127 个feature 特征序列，占两者总数的13.42%，占各自总数的31.20%和19.07%；翘嘴鲌和红鳍原鲌共有146 个feature 特征序列，占两者总数的22.36%，占各自总数的35.87%和37.25%；达氏鲌和红鳍原鲌共有171 个feature 特征序列，占两者总数的19.28%，占各自总数的25.68%和43.62%。可见，翘嘴鲌和红鳍原鲌肠道菌群相似性较高。

图2 三种鱼类样品feature 特征序列韦恩图Fig.2 Venn analysis of three fish species with features

三种鱼类肠道微生物α 多样性指数（表1）显示，达氏鲌observed species 以及Chao1 指数均高于其他两种鱼，表明其肠道微生物物种丰度较高；翘嘴鲌Shannon 指数和Simpson 指数均高于其他两种鱼；方差分析显示：三种鱼之间α 多样性指数差异不显著（P＞0.05），表明三种鱼类肠道微生物的丰度和多样性无显著差异。

表1 肠道菌群Alpha 多样性统计Tab.1 Alpha indices of intestinal bacteria community

2.3 肠道菌群组成分析

三种鱼类样品经与SILVA 以及NT-16S 数据库比对物种注释后，发现肠道菌群分属23 个门，其中1 个门未命名（图3）。其中相对丰度较高（≥1%）的门类有变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、螺旋菌门（Spirochaetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）。翘嘴鲌肠道菌群分为16 个菌门，以变形菌门（35.88%）、梭杆菌门（31.80%）、厚壁菌门（27.62%）和拟杆菌门（4.18%）为主，前三优势菌门占比高达95.30%。达氏鲌肠道菌群分属20 个菌门，其中变形菌门（57.26%）和梭杆菌门（30.41%）相对丰度远高于其他菌门，合计占比为87.67%；相对丰度超过1%的还有厚壁菌门（6.02%）、蓝细菌门（2.93%）和浮霉菌门（1.20%）。红鳍原鲌肠道菌群包含17 个菌门，其中变形菌门（62.98%）占绝对优势，其次为梭杆菌门（17.74%）、螺旋菌门（11.06%）和厚壁菌门（6.99%）。肠道菌群组成在门水平上的差异上主要表现为：翘嘴鲌厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度远高于另外两种鱼；达氏鲌蓝细菌门和浮霉菌门远高于另外两种鱼；红鳍原鲌螺旋菌门远高于另外两种鱼；但方差分析显示，三种间以上菌门相对丰度的差异不显著（P＞0.05）。

图3 三种鱼样品中门水平下细菌相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities in the three fish species at phylum level

在属水平上，三种鱼类肠道细菌相对丰度如图4 所示，相对丰度较高（≥2%）的12 个属分别为鲸杆菌属（Cetobacterium）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、气单胞菌属（Aeromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、Romboutsia、Brevinema、严格梭菌属（Clostridium_sensu_ stricto_1）、Epulopiscium、短波单胞菌属（Brevundimonas）、梭菌属（Clostridium）、ZOR0006、Barnesiellaceae_unclassified。其中鲸杆菌属、邻单胞菌属和气单胞菌属是三种鱼类肠道共有优势菌群，鲸杆菌属在翘嘴鲌和达氏鲌中的相对丰度为30.80%和30.41%，高于红鳍原鲌的17.68%；邻单胞菌属在翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌的相对丰度分别为21.61%、9.70%和31.74%；红鳍原鲌气单胞菌属相对丰度为23.50%，高于另外两种鱼（12.17%和10.72%）。除共有优势菌属外，翘嘴鲌还有Romboutsia（8.33%）、梭菌属（6.45%）、Epulopiscium（7.00%）、梭菌属（2.63%）和Barnesiellaceae_unclassified（2.14%）等优势菌属；翘嘴鲌优势菌属还包含假单胞菌属（24.42%）、短波单胞菌属（4.07%）和ZOR0006（2.56%）；假单胞菌属（4.60%）、Romboutsia（3.10%）、Brevinema（11.06%）、严格梭菌属（2.06%）是红鳍原鲌优势菌属。翘嘴鲌假单胞菌属的相对丰度仅为1.31%，而在达氏鲌的相对丰度在24.42%，差异较大。在相对丰度较高的12 个菌属中，在翘嘴鲌中并未检测到Brevinema。经方差分析发现：翘嘴鲌和达氏鲌严格梭菌属和梭菌属相对丰度差异显著（P＜0.05），其他菌属在三种鱼间差异不显著（P＞0.05）。

图4 三种鱼样品属水平下细菌相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities in the three fish species at genus level

在属水平下，以三种鱼类肠道微生物相对丰度最高的30 个物种分布来绘制聚类热图，并以颜色梯度及相似程度来反映其组成的相似性和差异性。翘嘴鲌（LB_CA）和红鳍原鲌（LB_CE）首先聚为一支，二者肠道微生物群落组成较为相似，后与达氏鲌（LB_CD）聚为一大类，与其距离相对较远。聚类分析显示的结果与韦恩图显示:翘嘴鲌和红鳍原鲌共有feature 特征序列数目较多的结果相一致（图5）。

3 讨论

本研究发现，翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌肠道菌群共有feature 特征序列数为73 个，分别占翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌feature 总数的17.94%、10.96%和18.62%。在α 多样性水平上，达氏鲌的observed_species 和Chao1 指数最高，即所含细菌物种丰度最大；翘嘴鲌的Shannon 指数和Simpson 指数最高，即其菌群多样性水平最高；但是，方差分析结果显示:三者之间无显著差异。王纯等[15]对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和团头鲂（Megalobrama amblycephala）的肠道菌群结构分析结果显示，两种鱼类消化道微生物群落结构差异不明显，认为食性相同的鱼类有相似的肠道菌群结构。而李秀玲等[16]研究发现，饲喂磷虾油和1∶1 磷虾油—豆油的鱼肠道微生物多样性较高，且不同脂肪源对肠道微生物多样性影响显著，即饵料的变化对肠道微生物群落结构有一定的影响。同一养殖系统中，投喂相同人工饲料的斑点叉尾（Ictalurus punctatus）与银鲫（Carassius auratus gibelio）、异育银鲫肠道微生物群落存在显著差异（P＜0.05），即物种差异会引起肠道菌群的不同[17]。本研究中三种鱼均为中上层凶猛肉食性鱼类，幼鱼阶段主要以浮游动物、水生昆虫等为食，成鱼则主要以浮游动物、小型鱼类和虾等为食，食物组成基本一致[18-21]。斑点叉尾与银鲫、异育银鲫分类地位相距较远，而本研究种三种鱼类分类地位相近，因此认为分类地位相近的肉食性鱼类，在相同的发育阶段和水环境下，其肠道菌群结构相似。

姜敏等[22]研究发现，洄游型刀鲚（Coilia nasus）的肠道微生物群落优势菌门为变形菌门、厚壁菌门和软壁菌门。李倩等[23]发现，池塘内循环流水养殖模式下太湖鲂鲌肠道微生物优势菌门为梭杆菌门、变形菌门和厚壁菌门。李英英等[24]采用高通量测序的方法分析了生长速度不同的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）肠道菌群的差异性，结果显示：大黄鱼肠道优势菌群为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门以及拟杆菌门。本研究中，千峡湖三种鱼类肠道菌群结构共计获得特征序列feature 1 094 个，分属23 个门，与前人研究类似，其优势菌门为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和螺旋菌门。不同种鱼类肠道优势菌门有所不同，但变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门更多的以优势菌门的身份出现。这可能与几种菌门的特点以及某些种类的功能有关。比如变形菌门是细菌中最大的门类，种类繁多；厚壁菌门则具有重要的促宿主能量吸收作用[25,26]。

鱼类食物的组成对肠道菌群结构有显著影响。如草食性鱼类肠道中可降解纤维素的菌属相对丰度较高[14]。淡水肉食性鱼类肠道菌群中可产生蛋白酶、脂肪酶的菌属丰度较高[1]。吴振聪等研究发现，摄食含鲍内脏多糖饲料的罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道中鲸杆菌属和邻单胞菌属丰度上调，不动杆菌属（Acinetobacter）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、Alsobacter 和Aquicella 等致病菌属丰度下调[27]。本研究结果显示，三种鱼优势菌属主要为鲸杆菌属、邻单胞菌属、气单胞菌属、假单胞菌属和Brevinema。鲸杆菌属不但可以产生丰富的维生素B12 和对宿主有利的蛋白质、脂肪和碳水化合物，还可以产生促进脂肪、蛋白质等的代谢分解的醋酸，同时其对潜在致病菌也有一定的抑制作用[28,29]，与本研究中三种鱼属肉食性鱼类相对应。邻单胞菌属、气单胞菌属和假单胞菌属均含有条件致病菌，但检测的三种鱼类样本均为健康鱼类，各菌属在肠道微环境中的功能作用及其相互作用还有待进一步研究。弧菌属（Vibrio）中多数都是致病菌，但研究发现，部分弧菌分泌的一些蛋白酶对宿主的发育可能起到一定作用[30]。本试验结果显示：翘嘴鲌和达氏鲌肠道菌群中严格梭菌属和梭菌属相对丰度差异显著（P＜0.05）。聚类分析表明：翘嘴鲌和红鳍原鲌肠道菌群组成更相近。Larsen 等[31]的研究表明，梭菌属细菌能够利用糖类以及发酵的碳水化合物等物质，具有降解纤维素的功能，可为宿主提供能量。郝耀彤等[32]给草鱼投喂人工饲料和苏丹草改变了草鱼肠道菌群结构。推测此种差异可能是达氏鲌食谱中各部分饵料所占比例与翘嘴鲌和红鳍原鲌不同有关，即翘嘴鲌和红鳍原鲌可能摄食了一定的植物性饵料。综上所述，三种鱼类同属肉食性鱼类，肠道微生物群落结构在门、属水平上存在差异，但不具有统计学意义，即其肠道菌群结构相似。本研究结果可为研究鱼类食性和物种对肠道菌群结构的影响以及翘嘴鲌等肉食性鱼类的健康养殖提供一定数据支撑。

结论

本研究借助高通量测序技术测定了千峡湖三种肉食性鱼类肠道菌群结构，分析了同一生境下食性相似、发育阶段相同、分类地位相近的鱼类之间肠道微生物的差异性。发现三种鱼类优势菌门为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和螺旋菌门；优势菌属为鲸杆菌属、邻单胞菌属、气单胞菌属、假单胞菌属和Brevinema。三种鱼类肠道菌群α 多样性差异不显著，推测分类地位相近的鱼类，在相同的发育阶段和水域环境下，其肠道菌群结相似。